[发明专利]一种靶向治疗结核病的ESAT6-CAR-T及其制备方法和应用

说明书

本发明属于结核病免疫治疗领域，具体涉及一种靶向治疗结核病的ESAT6‑CAR‑T及其制备方法和应用。所述ESAT6‑CAR‑T的保藏编号为CCTCC NO:C2022374，制备方法包括：步骤1：Mtb特异性分泌抗原ESAT6的克隆、表达、纯化与免疫；步骤2：抗ESAT6蛋白特异性单链抗体氨基酸编码序列的研制与筛选；步骤3：携带抗ESAT6蛋白单链抗体序列的慢病毒及逆转录病毒的制备；步骤4：ESAT6‑CAR‑T淋巴细胞的制备。ESAT6‑CAR‑T作为制备结核病的治疗药物、疫苗和检测试剂的应用。本发明相较于传统结核药物安全性更高；治疗效果好；对耐压结核与Mtb滞留菌感染有潜在价值；无脱靶效应。

技术领域

本发明属于结核病免疫治疗领域，具体涉及一种靶向治疗结核病的ESAT6-CAR-T及其制备方法和应用。

背景技术

结核病(tuberculosis)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)引起的高致死性传染病，至今仍是造成死亡人数最多的单一传染病。近年来发病率持续增加，全球每年新发病例近900万、死亡病例约200万，尽管我国在肺结核防控及诊疗方面取得了一定的成绩，但中国仍是结核病高负担国家之一。

结核病的治疗目前仍以传统的化学药物治疗为主，但结核药物在临床应用中暴露出诸多短板，例如：现行结核药物治疗周期长、易引发细菌耐药；结核药物(异烟肼、利福平等)毒副作用明显、一定程度上削弱了患者自身机体免疫力。此外Mtb这种古老的细菌寄生在宿主细胞内遇到特殊环境(营养缺乏、极端pH)会处于休眠态，这进一步减弱了传统药物的敏感性及杀伤能力。在上述要素的催化下，患者机体不能够产生足够的免疫应答与特异的免疫保护，而结核病的治愈与转归极大程度上依赖病人自身的免疫状态。

结核药物的长期使用使得耐药问题愈发严重，引发了不同种类的耐药(单耐药；多耐药；广泛耐药等)，给结核病的临床治疗带来了巨大的挑战。目前应对的方式依然为传统的化学药物疗法，在治疗效果极其有限同时，又造成了极大的毒副作用。不同程度损害了患者机体免疫力。患者自身免疫力影响着结核疾病的发生发展及转归。国内外研究视角动态转移到结核病的免疫治疗中，旨在纠正炎症反应，缩短治疗进程和提高疗效。多项研究显示了免疫治疗在结核病治疗的广阔前景。但是目前免疫制剂种类繁多，且多为外源制剂，存在一定的生物安全及隐患。因此避开传统药物、纠正患者免疫状态，开发新的免疫治疗方案对于解决Mtb感染至关重要。

嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)是一种新型高效的基因工程免疫细胞治疗制剂，是将识别特定抗原蛋白的嵌合抗原受体(CAR)借助病毒载体表达并锚定在细胞膜上，起到靶向识别、特异杀伤靶细胞的作用。起初应用于肿瘤的治疗，并在血液肿瘤的治疗中大放异彩，取得了很大的成功，在临床实验及多项研究中都呈现了良好的靶向性及特异性。结核分枝杆菌作为胞内寄生菌，机体内的清除需要固有免疫与获得性免疫的协作。经Mtb感染的抗原呈递细胞会呈递多种特有抗原，表明CAR-T细胞疗法对于Mtb感染具有良好的应用价值。

Mtb的菌体成分、分泌蛋白等多种成分可以激发患者机体的免疫功能，存在诸多理想的靶点抗原(Ag85、CFP-10)。其中ESAT6富含T细胞抗原表位，是公认的特异性靶蛋白且与其他分枝杆菌无交叉原性。而且已有多项研究针对该靶点开发拮抗药物，具有较高的应用价值。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供一种靶向治疗结核病的ESAT6-CAR-T及其制备方法和应用，以ESAT6为靶点抗原通过杂交瘤技术及测序技术获得高亲和力的特异性单链抗体(scFv)并进一步设计CAR-T细胞。通过识别ESAT6这一靶点抗原，利用CAR-T细胞与Mtb感染的细胞的协同机制，绕过化疗耐药机制，最大限度的激发患者自身免疫系统，解决免疫低下和胞内潜伏，利用细胞协同机制杀灭Mtb实现结核病治疗目的。