[发明专利]一种无血清细胞冻存液及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种无血清细胞冻存液包含80%(v/v)至90%(v/v)的无血清细胞培养基、4%(v/v)至6%(v/v)的二甲基亚砜、0.5%(w/v)至1.2%(w/v)的维生素、0.05%(w/v)至0.3%(w/v)的氨基酸、0.0001%(w/v)至0.0004%(w/v)的脂类、0.2%(w/v)至1.0%(w/v)的甘露糖、2%(w/v)至4%(w/v)羟乙基淀粉和余量的水。本申请的无血清细胞冻存液不包含血清，减少了动物来源的污染，含较低DMSO成分，降低了冻存液对细胞的毒性并且显著提高了细胞冻存后复苏的活率。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种无血清细胞冻存液及其制备方法和应用。

背景技术

由于细胞的特殊性，在细胞培养过程中，或在细胞建株和建系过程中，随着传代次数的增加，细胞的各种生物特性都会逐渐发生变化。因此，原始细胞种子的及时保存就显得尤为必要。在细胞悬液的冷冻过程中，冰晶的形成是导致细胞死亡的主要原因之一。细胞冻存液作为细胞冻存时必须使用的一种溶液，其作用是将需要冻存的细胞悬浮，并供给细胞生命代谢所需的营养物质，同时防止或减少冷冻冰晶对细胞的损伤。

传统的冻存液配制中含有血清，由于其动物来源的特性，会极大带来病毒等感染物质的可能，而且，血清来源受限，价格昂贵，所以其使用也必然会受到越来越多的限制。在冻存使用上来说，传统冻存方式需要用慢冻快融的方式来保存和保护细胞不受损，标准冷冻速度开始为-1到-2℃/分钟，当温度低于-25℃时可加速，到-70℃之后可直接投入液氮内(-196℃)，此方法较为繁琐，给操作带来较大不便。而无血清细胞冻存液中不含血清，即可避免动物来源病毒的污染。此外，在冻存方法上可以不采用程序性降温的方式，直接将重悬于无血清细胞冻存液中的细胞放在-80℃保存，给实验步骤缩减了复杂的工序。

无血清细胞冻存液里添加了细胞冻存保护剂，冻存保护剂分为细胞外保护剂和细胞内保护剂，细胞外保护剂即非渗透性保护剂，分子量较大被截留在细胞外，非渗透性保护剂通过稀释降低胞外电解质的浓度，减少溶质损伤，结合水分子，降低胞外自由水的含量，减少冰晶的形成。通常作为细胞外保护剂的物质成分有：海藻糖、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、羟乙基淀粉等。细胞内保护剂即渗透性保护剂主要作用是防止细胞内的冰晶形成、避免高浓度冻存剂的毒性和使细胞在耐受度内脱水，如甘油、二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇、丙二醇、甲醇、乙醇等。其中，DMSO具有毒性，高浓度的DMSO会对细胞造成伤害，降低DMSO含量或者找到它的替代性物质是较优的办法，可是目前来说，很难找到能完全替代DMSO的保护性物质。

发明内容

本发明的目的在于提供一种无血清细胞冻存液及其制备方法和应用，本发明相较于传统方式的冻存液的优势在于不含血清且DMSO含量较低，细胞冻存复苏后活率较高，该无血清冻存液具有高效、低毒、无外源因子和易于使用等优点，可广泛用于各种哺乳动物细胞的冷冻保存。

为实现上述技术目的，本发明提供的一种无血清细胞冻存液包含80％(v/v)至90％(v/v)的无血清细胞培养基、4％(v/v)至6％(v/v)的二甲基亚砜、0.5％(w/v)至1.2％(w/v)的维生素、0.05％(w/v)至0.3％(w/v)的氨基酸、0.0001％(w/v)至0.0004％(w/v)的脂类、0.2％(w/v)至1.0％(w/v)的甘露糖、2％(w/v)至4％(w/v)羟乙基淀粉和余量的水。

其中，所述无血清培养基为RPMI-1640培养基、DMEM高糖培养基、DMEM低糖培养基和F12培养基中的任意一种几种的混合物。

在一种优选的实施方式中，所述无血清培养基为DMEM培养基和F12培养基按照1:1混合组成的混合培养基。

优选地，所述脂类为乙醇胺；所述维生素为维生素C。

所述氨基酸为苏氨酸和丝氨酸。