[发明专利]造血干祖细胞及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种用于产生造血干祖细胞的多能干细胞，其能够表达或共表达(例如共过表达)转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10，

例如，所述用于产生造血干祖细胞的多能干细胞包含

i)包含转录因子RUNX1的编码核酸序列的表达构建体，

ii)包含转录因子HOXA9的编码核酸序列的表达构建体，和

iii)包含转录因子HOXA10的编码核酸序列的表达构建体，

由此所述多能干细胞能够共表达(例如共过表达)转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10。

2.权利要求1的多能干细胞，其不过表达除Runx1、Hoxa9和Hoxa10之外的其他转录因子，或其不包含除RUNX1、HOXA9和HOXA10之外的其他外源的转录因子的编码核酸序列。

3.权利要求1或2的多能干细胞，其是诱导性多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)。

4.权利要求1-3中任一项的多能干细胞，其中转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10来自哺乳动物，例如来自小鼠、大鼠、非人灵长类动物或人，优选来自人；

优选地，其中转录因子RUNX1包含选自SEQ ID NO:1-4和8-10的氨基酸序列；转录因子HOXA9包含选自SEQ ID NO:5-6和11的氨基酸序列；转录因子HOXA10包含选自SEQ ID NO:7和12的氨基酸序列；

优选地，其中所述RUNX1的编码核酸序列、HOXA9的编码核酸序列和HOXA10的编码核酸序列全部置于同一表达构建体；

优选地，其中RUNX1、HOXA9和HOXA10的编码核苷酸序列通过内部核糖体进入位点(IRES)序列或自裂解肽的编码核苷酸序列相互连接；

优选地，其中所述自裂解肽选自P2A、E2A、F2A和T2A，优选P2A；

优选地，其中所述RUNX1的编码核酸序列、HOXA9的编码核酸序列、HOXA10的编码核酸序列与表达调控元件可操作地连接；

优选地，其中所述表达调控元件包括启动子，例如诱导型启动子，例如强力霉素诱导型启动子；

优选地，其中所述表达构建体还包括用于筛选包含所述表达构建体的多能干细胞的筛选标记，例如抗性标记、营养缺陷型标记或荧光标记，优选地，所述筛选标记是潮霉素抗性标记或嘌呤霉素抗性标记；

优选地，其中所述转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10的表达构建体被稳定地整合进所述多能干细胞的基因组；

优选地，其中所述表达构建体被靶向整合进所述多能干细胞基因组中的选定位点，例如安全位点，优选Rosa26位点或Hipp11位点；

优选地，其中表达构建体通过同源重组例如序列特异性核酸酶介导的同源重组靶向整合进所述多能干细胞基因组中的选定位点。

5.一种产生造血干祖细胞的方法，包括：

(a)提供权利要求1-4中任一项的多能干细胞；和

(b)在使得转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10表达(例如共表达，优选共过表达)的条件下培养所述多能干细胞，从而产生造血干祖细胞。

6.权利要求5的方法，其中所述步骤(b)包括

(b1)使所述多能干细胞定向分化成生血内皮细胞；和

(b2)使所述生血内皮细胞与基质细胞共培养，由此生成造血干祖细胞。

7.权利要求6的方法，其中所述步骤(b1)包括：

在第一培养基中使所述多能干细胞形成拟胚体(EB)并培养第一时间段；

在第二培养基培养EB第二时间段；

在第三培养基培养EB第三时间段；和

任选地，收获生成的生血内皮细胞。

8.权利要求7的方法，其中

所述第一时间段为1-5天，可选的大约2-3天；

所述第二时间段2-7天，可选的大约3-4天；和/或

所述第三时间段为2-10天，可选的大约4-6天。