[发明专利]分泌抗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种分泌抗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法和应用，涉及鱼类免疫学领域。所述杂交瘤细胞株的制备方法，包括如下步骤：采用包含有罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白基因的逆转录病毒对细胞进行感染；将感染后的细胞作为抗原进行动物免疫；动物免疫后进行细胞融合，对融合细胞筛选和克隆，以获得所述杂交瘤细胞株。采用本发明制备方法制备得到的杂交瘤细胞株2C4G3、2B7F11、1C3G6、1D2E6或3C4H8，成功制备抗尼罗罗非鱼TCRα、TCRβ、CD4‑1、CD4‑2或CD8α的单克隆抗体，且充分保证了该单克隆抗体的特异性，为后续研究T淋巴细胞在硬骨鱼适应性免疫应答中的作用和机制提供了重要工具。

技术领域

本发明涉及鱼类免疫学领域，具体涉及一种分泌抗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法和应用。

背景技术

作为适应性免疫应答中关键的效应细胞，T细胞是一类具有膜抗原结合受体(TCR)，并识别抗原递程细胞(APC)表面MHCI和MHCII类分子递呈的抗原肽、介导细胞免疫防御的一类淋巴细胞，在免疫反应、平衡状态和记忆的建立和维持中发挥着十分重要的作用。最初T细胞的发育是在胸腺中开始的。淋巴样祖细胞在胸腺微环境的刺激下首先开始重排TCR基因，分别产生由α和β链组装的αβT细胞以及由γ和δ链组装的γδT细胞。γδT细胞形成后离开胸腺进入外周环境中，而αβT细胞即前T细胞在IL-7等细胞因子的诱导下开始表达CD4和CD8，进入双阳性(DP)细胞阶段。DP细胞经历阳性选择(自身MHC限制性)后进一步分化为CD4或CD8单阳性(SP)细胞。CD4单阳性T细胞和CD8单阳性T细胞经历阴性选择(自身免疫耐受)后成为成熟T细胞，通过血液循环进入外周免疫器官中。在外周环境中遭遇抗原后，TCRαβ异二聚体和CD3受体形成TCR复合物并识别抗原递呈细胞表面的抗原肽。而作为TCR的共受体的CD4和CD8分子分别结合到MHCII或MHCI分子上并识别MHC-抗原肽，增强TCR复合物和抗原递呈细胞的结合。MHC-II限制的T细胞被称为CD4T细胞(辅助性T细胞)，并根据免疫微环境的不同可继续分化为Th1、Th2、Th17和Treg细胞等，通过直接和间接机制介导其他免疫细胞活性,分别抵抗不同类型的病原入侵，或发挥免疫抑制作用限制炎症反应的持续扩大。而MHC-I限制的T细胞被称为CD8T细胞即细胞毒性T细胞，具有直接杀伤细胞内病原体和肿瘤细胞等的细胞毒性能力。

与哺乳动物相比，鱼类适应性免疫应答的研宄还很薄弱。硬骨鱼是拥有胸腺的最原始的脊椎动物之一，并且具有和哺乳动物相似的T细胞亚群。近年来在T细胞基因的克隆方面展开迅速，包括TCRα、TCRβ、CD4、CD8等分子已陆续在多种硬骨鱼中被报道。与哺乳动物中不同的是，除了与哺乳动物一样包含4个Ig-like结构域的CD4分子即CD4-1之外，一些硬骨鱼中还发现了包含2或3个Ig-like结构域的CD4分子，并命名为CD4-2，这种差异也表明了原始T细胞的不同之处。尽管针对硬骨鱼T细胞的单克隆抗体已经陆续被研制成功，但是绝大多数是利用原核重组系统建立的制备技术，无法充分保证膜蛋白免疫原的完整性和免疫原性。此外，由于鱼类物种数目极多，进化地位差异很大，对单一物种T细胞亚群的全面认知和深入探索是十分有必要的。

近年来，罗非鱼(包括尼罗罗非鱼Oreochromisniloticus)作为重要的淡水养殖经济鱼类，在中国乃至全球水产养殖业中的重要性日益显著。然而随着养殖规模快速扩展,水体环境发生变化,罗非鱼的病害逐渐增多,特别是细菌性疾病日益严重。在目前苗种质量、养殖环境状况和饲料质量水平难以在短期内得到有效改善的情况下,养殖病害的潜在危害风险较大，严重影响我国罗非鱼养殖产业的发展。对于罗非鱼免疫机制的研究迫在眉睫。因此，制备尼罗罗非鱼T细胞单克隆抗体，探究T细胞各亚群的分化和功能机制，对于鱼病防治，疫苗开发以及填补硬骨鱼适应性免疫进化研究具有十分重要的现实意义。

发明内容