[发明专利]慢病毒载体、重组干细胞及其应用

说明书

本发明公开了用于过表达hTERT的慢病毒载体，包含所述慢病毒载体的重组干细胞，以及所述慢病毒载体和包含所述慢病毒载体的重组干细胞在制备用于治疗相关疾病药物中的应用。本发明的慢病毒载体包含载体质粒，所述载体质粒包括含有ψ序列的5’LTR、3’LTR、在5’LTR和3’LTR之间的目的基因序列，以及与所述目的基因序列可操作连接的启动子序列和翻译起始序列，所述目的基因序列为hTERT的编码核苷酸序列。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种慢病毒载体及含有该慢病毒载体的具有高增殖能力的重组干细胞及其制备方法和应用。

背景技术

目前，国内已经有超过30款间充质干细胞药品注册申请临床试验，得到国家药监局(NMPA)默示许可，涉及各种天然组织来源的间充质干细胞(脐带、胎盘、脂肪、牙髓和宫血)和一种胚胎干细胞来源的间充质干细胞。但是天然的间充质干细胞增值传代能力有限，传代次数在10～30代之间，这使得作为产品甚或药品时产品的一致性很难保证，同时也增加了批次检测的频率和成本。临床用的这种细胞代数一般在3～5代，以保证细胞活力。

据不完全统计，目前市售的间充质干细胞产品中，单次的治疗费用大都从几万美金起步，甚至十几万美金，没有很好的体现药效经济学。显然，若增加间充质干细胞的增殖能力，增加同一批次的产量，对细胞产品的一致性和质量控制以及降低高昂药价，促成百姓用药具有重要意义。

如今，既有iPSC可进行规模化量产，符合药品化的特点，也有天然MSCs，天然NK差强人意的临床表现。但是这种途径很难保证iPSC的完全分化和去除，或有残留，安全风险令人堪忧。从天然的MSCs入手，在其高安全性的基础上，提高其增值能力的策略或更有潜力。用于研究或医学治疗应用的细胞在体外扩增受到其有限的增殖寿命的限制。间充质干细胞(MSCs)由于其再生和免疫抑制特性，已被用于治疗多种免疫相关疾病，在再生医学领域具有巨大的治疗前景。但间充质干细胞由于其有限的增殖能力，无法获取大量的细胞，且受原代细胞获取过程的复杂性和细胞培养过程中的异质性限制，无法大量应用于临床研究。利用iPSCs分化获得MSCs的策略风险较高。

发明内容

为了解决间充质干细胞增殖活性低，导致很难成药和成本高昂的问题，本发明提供了一种具有高增殖能力的间充质干细胞，其能够用于治疗与干细胞治疗相关的疾病。

为了实现本发明的目的，在第一方面，本发明提供了一种慢病毒载体，所述慢病毒载体包含载体质粒，所述载体质粒包括含有ψ序列的5’LTR、3’LTR、在5’LTR和3’LTR之间的目的基因序列，以及与所述目的基因序列可操作连接的启动子序列和翻译起始序列，所述目的基因序列为hTERT的编码核苷酸序列。

在一些实施方式中，所述载体质粒的3’LTR和5’LTR包括一个或多个修饰。

在一些实施方式中，所述5’LTR和3’LTR的U3可以被缺失或突变。

在一些实施方式中，所述3’LTR是缺失了U3区域的3’LTR(3’LTR-ΔU3)。

在一些实施方式中，所述5’LTR是缺失了U3区域的5’LTR(5’LTR-ΔU3)。

在一些实施方式中，所述载体质粒的5’LTR的启动子选自巨细胞病毒CMV启动子、劳斯肉瘤病毒RSV启动子和猿猴病毒SV40启动子，优选选自劳斯肉瘤病毒RSV启动子。

在一些实施方式中，与hTERT的编码核苷酸可操作连接的启动子选自短延伸因子1A(EF1α)启动子或其转录活性片段，RSV启动子和猿猴病毒SV40启动子，优选选自短延伸因子1A(EF1α)启动子。

在一些实施方式中，hTERT的编码核苷酸可操作连接有EF1α启动子和Kozak翻译起始序列。

在一些实施方式中，所述载体质粒还包括筛选标记物的编码核苷酸。