[发明专利]O型口蹄疫病毒多表位病毒样颗粒抗原及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种O型口蹄疫病毒多表位病毒样颗粒抗原及其制备方法和应用。所述的O型口蹄疫病毒多表位病毒样颗粒抗原是选取O型口蹄疫病毒5个拓扑型的代表毒株O/Tibet/CHA/99，O/Mya98/BY/2010，O/HN/CHA/93、O/XJPS/CHA/2017和Cathay的抗原表位依次顺序串联后与SpyCather和噬菌体AP205基因串联，然后再与前4个毒株的表位串联，形成的重组抗原蛋白，该重组蛋白能够自组装成VLP抗原。免疫学试验结果显示，该VLP抗原具有良好的抗原性，其与O型口蹄疫病毒的抗原反应性没有明显的差异，可替代口蹄疫病毒灭活抗原建立检测方法。利用该VLP抗原制成的疫苗不仅能诱导产生高水平的保护性抗体，而且能保护免疫动物抵抗病毒攻击。且不受动物种属限制，对猪牛羊O型口蹄疫均有免疫保护作用。

技术领域

本发明涉及一种病毒样颗粒抗原及其制备方法和应用，特别涉及一种O型口蹄疫病毒多表位病毒样颗粒抗原及其制备方法和应用，本发明属于医药技术领域。

背景技术

口蹄疫是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起主要经济畜种猪牛羊发病的重大动物疫病，OIE将其列为必须通报的动物疫病，我国将其列为重点防范的一类动物传染病。我国采取疫苗免疫与扑杀相结合的策略有效防控口蹄疫疫情。随着我国经济实力的不断增强、国际地位的不断提升，我国制定了逐步净化和根除口蹄疫的目标。要实现此目标，安全、高效、可鉴别诊断的口蹄疫新型疫苗是不可或缺的重要技术手段，虽然采用基因操作手段可获得标记口蹄疫灭活疫苗，但是整个研究和生产过程中仍然需要动用活病毒，需要高级别的生产设施，生物安全风险依然存在。

为了解决口蹄疫灭活疫苗研发和生产存在生物安全风险、成本高和疫苗成分复杂等关键科学问题。利用反向疫苗学技术，以病原的保护性抗原和/或抗原表位为材料，研发环境友好、生物安全、可鉴别诊断的高效基因工程亚单位疫苗已成为疫苗研究的新方向。但目前大多数基因工程疫苗以保护性抗原为研究对象，通过真核/原核表达系统表达重组蛋白，以获得的重组蛋白多形式，包括重组蛋白混合物，重组融合蛋白等相对简单的形式；也包括表达完整的病毒衣壳蛋白，或分段表达重组蛋白体外组装成VLP。但这些蛋白表达形式存在诸多的缺点和不足，如单基因或多基因联合形式表达的重组蛋白，如不能保证正确的抗原结构，会影响免疫效果。值得一提的是，中国农业科学兰州兽医研究所成功通过分段表达，体外组装获得VLP，并获得了一类新兽药证书。

为了研发出生物安全、环境友好、免疫高效的口蹄疫新型基因工程亚单位疫苗，提升表位疫苗免疫功效、并解决大规模生产过程中的关键技术问题，本发明以口蹄疫病毒的保护性抗原表位为元件，利用生物的天然自组装蛋白分子为骨架，设计、研制结构和大小接近天然病原的仿生结构纳米VLP抗原及其疫苗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种O型口蹄疫病毒多表位病毒样颗粒抗原及其制备方法和应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明利用噬菌体表面展示技术，以O型口蹄疫病毒的保护性抗原表位为元件，以噬菌体AP205为骨架，设计O型口蹄疫病毒的多表位串联DNA，并将其与AP205基因融合构建原核重组表达质粒，表达多表位VLP重组蛋白，研制出口蹄疫O型多表位仿生纳米VLP抗原及其疫苗。本发明成功构建原核重组表达质粒，表达、纯化和组装仿生纳米VLP(多表位VLP)，ELISA结果显示，重组VLP具有良好的抗原性，其免疫反应性与FMDV灭活抗原没有明显差别，提示该多表位VLP可作为检测抗原替代FMDV灭活抗原，用于O型口蹄疫病毒抗体的检测及其试剂盒的研制。更为重要的是，该重组VLP与ISA206 VG佐剂配伍制备的疫苗，免疫动物后能诱导高水平的保护性抗体，加强免疫后抗体水平更高，持续期长，攻毒后100％(5/5)保护。