[发明专利]酶、基因工程菌及其催化生产麦角硫因的方法

说明书

本申请提供一种生产麦角硫因的方法，包括如下步骤：组氨酸甜菜碱经截短的或未截短的L‑组氨酸甜菜碱硫化酶催化获得麦角硫因。并提供了一种截短的L‑组氨酸甜菜碱硫化酶、生物材料、酶的组合、基因工程菌和全细胞催化剂。

技术领域

本申请涉及生物技术领域，尤其涉及酶、基因工程菌及其催化生产麦角硫因的方法，具体涉及一种酶催化生产麦角硫因的方法、截短的L-组氨酸甜菜碱硫化酶及其应用、编码L-组氨酸甲基化酶的核苷酸序列及其应用、截短的L-组氨酸甜菜碱硫化酶、L-组氨酸甲基化酶和S-腺苷蛋氨酸合酶在酶催化生产麦角硫因中的应用、以及，酶的组合。

背景技术

麦角硫因(Ergothioneine，简称ERT)是一种含硫的组氨酸衍生物。麦角硫因具有抗氧化、清除自由基及参与细胞内能量调节等功能，与已知的抗氧化剂维生素C和谷胱甘肽相比，其化学性能更稳定，抗氧化能力更显著，因此麦角硫因具有广泛的生物医药应用前景。

目前麦角硫因主要是通过化学合成法、提取法和生物发酵法获取。化学法合成具有功效的左旋麦角硫因十分困难，工艺繁琐且收率低，而提取法主要是通过对食用真菌进行化学萃取的方法来获取，成本高，产率低且会存留化学试剂。传统的微生物发酵法主要利用蕈菌等食用真菌发酵合成麦角硫因，但由于发酵周期长，产量仅为毫克级别，且分离纯化困难，因此不适用于大规模工业化生产。

近年来随着麦角硫因在好氧生物和厌氧生物中合成路径的解析，利用基因工程开发高产麦角硫因的基因工程菌株逐渐兴起。在原核生物中，以组氨酸和半胱氨酸为前体，麦角硫因由egtABCDE基因簇编码的egtD，egtB，egtA，egtC和egtE 5个酶催化合成；在真核生物中，组氨酸经egt1催化两步反应生成组氨酸甜菜碱半胱氨酸亚砜，随后经egt2催化生成麦角硫因；在厌氧生物中，前体物质组氨酸仅需eanA，eanB两个酶经两步反应就可生成麦角硫因。目前麦角硫因基因工程菌主要是以大肠杆菌、酵母或真菌为底盘细胞，通过引入麦角硫因异源合成酶构建细胞工厂。专利文献CN107250347B公开了利用基因工程改造的曲霉菌，发酵产量可达438mg/L。专利文献CN111534535B公开了利用基因工程改造的圆红酵母，通过引入Neurospora crassa来源的egt1，工程菌摇瓶发酵产量最高可达82.1mg/L。专利文献CN106661585B公开了利用基因工程改造的大肠杆菌，通过引入分枝杆菌的麦角硫因合成基因簇egtABCDE，工程菌发酵产量可达12mg/L。专利文献CN112251392B公开了利用基因工程改造的大肠杆菌，通过改造组氨酸合成路径提高前体组氨酸含量，并引入Mycobacteriumsmegmatis来源的麦角硫因合成基因，工程菌摇瓶发酵26h产量可达84.7mg/L。专利文献CN104854245B公开了一种新的麦角硫因合成途径，以L-组氨酸或组氨酸甜菜碱为底物通过egt1和egtE两个酶催化合成麦角硫因。目前公布的麦角硫因基因工程菌产量仍达不到工业化生产的要求，而且利用异源宿主合成麦角硫因增加了宿主细胞的代谢负担，细胞容易代谢失衡，在工业放大时容易出现生长抑制或死亡的情况。

体外酶催化法制备麦角硫因也有报道，该方法具有效率高、产物纯度高的优点。专利文献CN112301013A公开了一种用于麦角硫因制备的复合酶，利用三个酶经过两步的体外催化实现组氨酸到麦角硫因的合成，由于中间产物组氨酸甜菜碱及硫转移酶稳定性差，第一步反应结束后需经过滤除酶并充氮气后才可进行下一步的反应，而且仍未解决一些关键技术性问题，限制了麦角硫因的生物制造达到高产的目的。这些问题主要有两方面：(1)所用egtD酶活力低，导致中间产物组氨酸甜菜碱供应不足；(2)反应中最为重要的硫转移酶可溶表达量低，需制备大量的酶用于反应，增加了工业化成本。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本申请提供一种酶催化生产麦角硫因的方法、截短的L-组氨酸甜菜碱硫化酶及其应用、编码L-组氨酸甲基化酶的核苷酸序列及其应用、截短的L-组氨酸甜菜碱硫化酶、L-组氨酸甲基化酶和S-腺苷蛋氨酸合酶在酶催化生产麦角硫因中的应用、以及，酶的组合。

具体来说，本申请涉及如下方面：