[发明专利]一种基于无缝克隆技术的全新质粒定点突变方法

说明书

本发明公开了一种基于无缝克隆技术的全新质粒定点突变方法、试剂盒及应用，属于基因工程技术领域。基于无缝克隆原理优化方法，目标突变点设计在引物5′端，可插入50bp以内的连续位点或间隔位点突变操作，50bp以内的插入突变相较于其他突变方法进一步提升；可进行单点或多点突变(最多5个间隔位点)的替换点突变；可以进行无长度序列限制的删除点突变操作。该方法解决了质粒模板必须被甲基化的限制问题，通过使用极低的模板使用量1ng和极高的PCR扩增效率，使突变后的产物以极高的比例压制未被突变的模板质粒，此方法效率极高。使用该方法定点突变质粒不需要购买昂贵的商业化试剂盒，经济成本很低，适用范围更广。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基于无缝克隆技术的全新质粒定点突变方法。

背景技术

定点突变是指通过PCR等方法有效地向目的基因中引入任何所需的DNA变异，包括碱基的添加、删除、点突变等。此技术能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是实验室中改造、优化基因常用的手段，也是研究蛋白质结构和功能之间复杂关系的有力工具。DNA定点突变技术是基因工程技术领域最常用及重要的技术之一，广泛应运于各种领域研究，如基因调控因子，DNA和蛋白相互作用，蛋白结构和功能，酶学活性位点的确定等等。

目前广泛使用的质粒定点突变技术存在以下主要弊端：

质粒模板必须被甲基化，DpnI限制性内切酶才能切割甲基化质粒，像JM110这类的甲基化基因dam、dcm缺失的菌株抽提的质粒则无法被DpnI消化，会导致产生大量的未被突变的质粒。

突变效率问题，虽然商业化的试剂盒能够突变绝大多数目标质粒，但是对于长度超过14K的质粒仍然有局限性，且商业化的试剂盒价格昂贵，实验经济成本较高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于无缝克隆技术的全新质粒定点突变方法，该方法解决了质粒模板必须被甲基化限制、解决了现有试剂盒突变的效率差、对于样本使用量大的的技术问题。

本发明通过以下技术方案实现：

一种基于无缝克隆技术的全新质粒定点突变方法，包括采用对一个或多个突变位点分别设计引物，每个突变位点引物扩增、重组后得到一个环化突变质粒；每个所述突变位点位于引物序列5′端；

采用无缝克隆技术将每个突变位点扩增出的突变基因片段进行无缝拼接、重组构建出具有多个突变位点的环状质粒。

作为优选地，所述突变位点引物中5′端，正反引物具有15-20bp的互补序列。

作为优选地，所述多个突变位点具体如Tn所示，n＝1/2/3/4/5；

所述扩增的方法为：T1的正向引物与T2的反向引物扩增；T2的正向引物与T3的反向引物扩增；T3的正向引物与T4的反向引物扩增；T4的正向引物与T5的反向引物扩增；T5的正向引物与T1的反向引物扩增。

关于点突变方法都是重组片段越多(点越多)，效率越低。

作为优选地，所述每个突变位点的选取是以基因序列50bp以内为基准进行碱基替换和插入。

上述过程中删除则可以任意长度的序列。

作为优选地，利用PCR扩增质粒模板后，将所述无缝克隆技术构建的含目标突变位点的环状质粒转化到感受态细胞中，筛选突变克隆。

作为优选地，所述方法包括如下步骤：

S1、设计突变引物，引物5′端序列上携带有突变位点的突变序列，通过PCR引入的方式实现定点突变；

S2、以原始质粒作为模板，突变引物扩增原始质粒模板进行PCR后，进行突变；