[发明专利]一组穿心莲内酯合成相关P450细胞色素酶及其应用

说明书

本发明公开了一组穿心莲内酯合成相关P450细胞色素酶及其应用，属于生物工程领域。本发明在穿心莲来源原始序列CYP71A8和CYP71D10的基础上，截短信号肽序列，成功实现了截短信号肽后CYP7A8和CYP71D10的异源表达。本发明以酿酒酵母CEN.PK2‑1D为宿主，敲除基因组上的ROX1、GAL80基因，并在ROX1位点整合表达GGPP合酶和CPS二萜合酶的编码基因；游离表达CYP71A8和CYP71D10和ApCPR，成功构建重组酿酒酵母，实现了3,15,19‑Trihydroxy‑8(17),13‑ent‑labdadiene‑16‑oicacid的从头合成，相比空白实现产物峰的响应值达1.9*106，是目前生物合成3,15,19‑Trihydroxy‑8(17),13‑ent‑labdadiene‑16‑oicacid的唯一相关报道，此策略为解析穿心莲内酯生物合成途径，和利用代谢工程合成穿心莲内酯及其相关衍生提供了必要的参考。

技术领域

本发明涉及一组穿心莲内酯合成相关P450细胞色素酶及其应用，属于应用微生物及酶工程领域。

背景技术

细胞色素氧化酶(cytochrome P450，P450)属于血红素氧化酶超家族，因还原态的血红素氧化酶与CO结合形成复合物在450nm附近有最大吸收峰而被命名为细胞色素P450酶。根据P450酶的细胞定位以及氧化还原伴侣蛋白(NADPH-cytochrome P450 reductase，CPR)的组成，可以分为5类Class，其中Class I需要额外的电子传递蛋白将电子NAD(P)H传递到P450酶活性中心进而完成整个催化过程。

ent-Copalol和3,15,19-Trihydroxy-8(17),13-ent-labdadiene-16-oic acid是含有四个异戊二烯的二萜化合物，存在于草本植物穿心莲中，是穿心莲体内合成穿心莲内酯的两个重要的中间化合物，穿心莲内酯具有清热解毒、消肿止痛作用，被誉为“天然抗生素药物，然而目前关于合成穿心莲内酯的P450酶、途径物质3,15,19-Trihydroxy-8(17),13-ent-labdadiene-16-oic acid的催化反应相关信息未曾有过报道。因此，研究合成过程中CYP450酶的活性和功能对了解穿心莲内酯合成全途径具有重要意义。

CYP450酶为膜蛋白，其形成需要一系列的翻译后修饰。真核表达宿主具有较完善的内质网、高尔基体等内膜结构的翻译后修饰系统，使表达出的异源蛋白更接近于其天然构象，真核微生物通常被认为是异源表达CYP450酶的合适系统。另外，真核微生物内源的CPR可介导电子有效的向CYP450酶传递，有助于CYP450酶发挥其催化功能，催化合成3,15,19-Trihydroxy-8(17),13-ent-labdadiene-16-oic acid应用了真核微生物的天然优势(图1)。根据现有的研究，暂无实现从头合成3,15,19-Trihydroxy-8(17),13-ent-labdadiene-16-oic acid的真核微生物重组菌

发明内容

本发明中穿心莲来源的CYP71A8和CYP71D10属于Class I的CYP71家族，需要电子传递蛋白催化活性，但具体生物功能未被报道过，因此本发明为首次对CYP71A8和CYP71D10进行异源表达并公布其催化功能。

本发明的第一个目的是提供穿心莲来源的CYP450酶在催化合成3,15,19-Trihydroxy-8(17),13-ent-labdadiene-16-oic acid中的应用。

在一种实施方式中，所述穿心莲来源的CYP450酶为CYP71A8和CYP71D10。

在一种实施方式中，所述CYP71A8的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述CYP71D10的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在一种实施方式中，所述CYP71A8的N端截短32位氨基酸，所述CYP71D10的N端截短28位氨基酸。