[发明专利]基于“Cu(II)to Cu(II)”机理的组蛋白乙酰转移酶电化学传感器的制备及应用

说明书

本发明是一种基于“Cu(II)to Cu(II)”机理的组蛋白乙酰转移酶电化学传感器的制备及应用，首先CoA中的巯基与Cu(II)原位产生CoA‑Cu(II)复合物，可以视作具有多个腺嘌呤作为侧基的纳米链状复合物，该复合物可以通过其腺嘌呤侧基与GO通过π‑π共轭效应结合，从而结合固定在电极表面，利用FSCV技术采集Cu(II)的电压信号，因为CoA与Cu(II)的聚合作用可实现CoA的电化学传感分析，又因为CoA是HAT催化反应的产物可实现HAT的电化学传感分析，改变CoA或是HAT浓度，可以获得一系列不同浓度CoA与HAT对应的FSCV信号大小；加入抑制剂漆树酸/C646时，HAT活性被抑制，无法生成CoA，使得复合物无法形成，从而实现HAT抑制剂的筛选。基于此构建了一种快速、简单、可靠稳定、灵敏度高的FSCV分析方法。

技术领域

本发明涉及一种特殊的“Cu(II)to Cu(II)”机理，尤其是涉及基于辅酶A-铜离子复合物的组蛋白乙酰转移酶电化学传感器的制备及其在辅酶A、组蛋白乙酰转移酶在分析传感中的应用，属于功能生物材料和生物传感技术领域。

背景技术

组蛋白乙酰化是在真核生物基因转录过程中的重要修饰过程，受组蛋白乙酰转移酶(HAT)调控，主要通过改变组蛋白乙酰标记在局部染色质区域的分布从而影响局部染色质松弛状态，来调节基因转录激活，HAT是可以催化组蛋白中发生乙酰化的一类酶，作为乙酰基供体的乙酰辅酶A(Ac-CoA)，乙酰基从Ac-CoA转移到底物肽的特定赖氨基残基上，调节染色体结构和调控基因的表达。一旦细胞内乙酰化/去乙酰化之间的动态平衡被破坏，就会导致各种疾病，如帕金森氏病、白血病，甚至癌症。转录辅激活物p300是一种最常见的组蛋白乙酰转移酶，通过乙酰化染色质调节基因表达，其介导着许多细胞生理活动过程，如DNA损伤修复、基因转录的调控、细胞分化与凋亡等。因此，检测HAT p300的活性对于研究相关生物学过程和疾病发生的发展有着很重要的研究意义。

目前，已经有很多方法来检测HAT p300的活性，比如荧光、电化学发光、电化学等，其中电化学方法因为其高灵敏度、低成本、设备简单、操作便捷、小型化可能等独特优势受到广泛关注，但是传统的电化学方法稳定性和灵敏度有限，针对这两个问题，本课题组将电化学检测技术与信息工程技术相结合，进行改装设计构建了一套快速扫描装置，其中最经典的快速扫描循环伏安法(FSCV)作为循环伏安法(CV)的一种变体，是用高扫描速度完成特定部位神经递质和痕量的检测呈现的电化学方法，能够有效提高检测灵敏度、增加分析结果的可靠性。FSCV作为一种功能强大的电化学分析技术，最常见的方法是将特别设计的恒电位仪与电极结合，将施加的电势以高扫描速度进行扫描，产生亚秒级的时间分辨率和亚微米级的空间分辨率。目前，FSCV方法仅仅应用于小分子物质(如金属离子、多巴胺等)的检测，但是对于大分子尤其是生物大分子的检测出现“空白”现象，最重要的原因是在生物大分子能够给系统带来较大的背景信号，没有办法实现直接检测，因此，在生物化学领域，FCSV方法的广泛使用仍然是一个亟待解决的大课题。

对于经典电化学，金属离子二价铜(Cu(II))由于其本身的氧化还原活性在低扫速条件下发生“Cu(II)to Cu(0)”转变，导致电化学信号极不稳定，且灵敏度受到影响。针对此，本发明基于快速扫描循环伏安提出了“Cu(II)to Cu(II)”机理，基于CoA(含1个巯基)与Cu(II)的结合作用，利用CoA上的腺嘌呤结构与石墨烯二维材料(GO)的共轭作用制作电化学基底，通过Cu(II)的连续电压信号输出实现CoA生物小分子检测；由于CoA是HAT p300催化反应的产物，该传感方法可以用于间接地检测HAT p300活性及其小分子抑制剂的筛选，从而避免了生物大分子对背景信号的影响。目前尚未见联合电化学快速扫描技术、“Cu(II)to Cu(II)”机理、CoA-Cu(II)复合物检测CoA、HAT p300的电化学传感器，该方法具有较低的灵敏度，较好的信号稳定性，并具有较好的新颖性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简便、灵敏度高、特异性好、检测速度快、成本低廉的基于“Cu(II)to Cu(II)”机理的组蛋白乙酰转移酶电化学传感器的制备及应用。