[发明专利]一种上皮间充质转化的三维肿瘤细胞体外模型及其构建方法

说明书

本发明公开了一种三维上皮间充质转化的肿瘤细胞体外模型及其构建方法，涉及生物技术领域。该构建方法包括：肿瘤细胞经二维培养后，使用基质材料包裹细胞同时药物诱导肿瘤细胞进行上皮间质转化，获得所述三维上皮间充质转化的肿瘤细胞体外模型。本发明的三维上皮间充质转化的肿瘤细胞体外模型稳定，上皮间质转化标志物表达符合预期，细胞存活率无明显下降，并且通过调节上皮间充质转化模型中胶原浓度及诱导药物浓度，可以精准调控体外三维上皮间质转化肿瘤细胞模型的基质硬度等力学微环境。因此，该发明在肿瘤发生发展机制、药物研发、筛选检测、体外肿瘤治疗及预后等研究方向有广阔应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种上皮间充质转化的三维肿瘤细胞体外模型及其构建方法。

背景技术

上皮间充质转化(epithelial–mesenchymaltransition)，在生物的胚胎发育和癌症的发生发展中都起着重要的作用，肿瘤细胞的上皮间充质转化是促进肿瘤迁移和干性发生的重要因素。近年来的研究表明，肿瘤细胞微环境中的生物化学因素(如TGF-β刺激)可诱导肿瘤细胞发生上皮-间质转化，而微环境中的物理/力学因素(如空间几何约束、机械拉伸等)也参与调节这一细胞表型转化过程。然而，在生物物理/力学因素微环境对诱导细胞EMT表型的具体机制仍有待探索。

几十年来，大部分肿瘤研究还停留在依托二维细胞培养和动物实验的基础上。研究表明，三维肿瘤微环境对于肿瘤在体内的生长起着至关重要的作用。在体外的二维培养不仅改变了肿瘤的生长环境对于肿瘤细胞与细胞之间、细胞与基质之间的相互作用也改变了细胞的生长方式。相比2D培养的单层细胞，三维模型的出现在体外给探究细胞结构、粘附、机械传导的信号途径提供了更好的平台，为肿瘤药物研发筛选和检测提供了新的手段。此外，相比于异种移植构建肿瘤模型，3D细胞培养可以更高效的反应体内肿瘤的生长和发育情况。尽管3D细胞培养是一项具有创新性的组织工程技术，但仍有一些问题有待解决，包括维持细胞活性、结构框架等问题。将上皮间充质转化与3D细胞培养结合在一起，可以为肿瘤进一步病理和药理研究提供新的思路和方向。

发明内容

本发明的目的是提供一种三维上皮间充质转化的肿瘤模型构建方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明将上皮间充质转化的肿瘤细胞及基质材料共培养得到三维上皮间充质转化的肿瘤细胞体外模型，填补肿瘤上皮间充质转化机制体外研究中三维层面的缺失，可以应用于药物研发、筛选和检测，体外肿瘤治疗的研究等方面。

为实现上述目的，本发明方法包括以下步骤：

1.细胞准备

细胞在5％CO₂细胞培养箱37℃培养。培养基用DMEM完全培养基。

细胞复苏时，预热恒温水浴锅至37℃，快速将细胞从液氮取出，放置于水浴锅中，晃动冻存管使细胞悬液完全融化。准备15ml离心管，做好标记后，加入完全培养基5ml，加入解冻的细胞。同时设置离心机转速为1200rpm，放入盛有细胞悬液的离心管后，离心3min，吸去上清，用完全培养基重悬后全部移细胞培养容器中放置于5％CO2细胞培养箱37℃培养。

细胞传代时，当细胞已达到培养皿底面的80％密度时可执行以下操作。吸去培养皿中的完全培养基后，用在水浴锅中预热到37℃的PBS缓冲液清洗，以避免残留培养基对胰酶作用的影响，吸去PBS缓冲液，加入胰蛋白酶消化细胞。消化时间结束后加入完全培养基终止消化并将细胞悬液移至15ml离心管中，1200rpm离心3min后吸去上清。用完全培养基重悬后，根据实验需求将部分细胞悬液移至细胞培养容器中放置于5％CO2细胞培养箱37℃培养。

2.三维模型构建

胶原以1:10的比例将胶原与10×PBS充分混合，使用0.1M的NaOH调整pH至7.0(7.0-7.5效果相同)，得到混合物。将混合物铺至细胞培养容器底部后加入2×105/mL(1×105-5×105/mL均可)细胞。将细胞培养容器皿中放置于5％CO2细胞培养箱37℃培养。获得细胞体外三维模型。