[发明专利]合成白藜芦醇的解脂亚洛酵母菌株及其应用

说明书

本发明公开了合成白藜芦醇的解脂亚洛酵母菌株及其应用，属于基因工程和生物工程技术领域。本发明首先获得了一株能够异源生产对香豆酸的解脂亚洛酵母重组菌株，通过游离质粒表达筛选不同的融合标签和连接肽长度融合表达Pc4CL1和VvSTS，以及利用不同启动子强度筛选出最优的白藜芦醇产量。最终，将最优的组合定点整合至基因组上以及增加一个融合基因拷贝数，在解脂亚洛酵母中实现了白藜芦醇的高效合成，使摇瓶产量达到201±3.3mg/L。本发明将植物异源代谢途径整合到解脂亚洛酵母实现了白藜芦醇的生产，为后续的黄酮类化合物生物合成奠定了基础，对于合成生物学的发展具有潜在的价值和意义。

技术领域

本发明涉及合成白藜芦醇的解脂亚洛酵母菌株及其应用，属于基因工程及生物工程技术领域。

背景技术

白藜芦醇是天然存在于葡萄、浆果、虎杖和花生中的黄酮类多酚化合物。在植物中，白藜芦醇作为植物抗毒素抵御病原体入侵和感染。在自然界中，白藜芦醇有顺式和反式两种异构形式，但反式异构体是主要的生物活性形式。临床研究表明，白藜芦醇可以有效地改善糖尿病，心血管疾病和神经性系统疾病。此外，白藜芦醇也被作为食品和化妆品的原材料，有着广泛的商业应用价值。

白藜芦醇主要的获得方式是从植物中提取，但是植物提取的方法受季节性的影响较大，并且工艺复杂、生产成本高、产量低。虽然目前可以通过采用化学合成来增加白藜芦醇的产量，但生产过程复杂、需使用大量的有机溶剂以及产生许多副产物限制了其大规模生产。相比之下，采用微生物发酵法合成白藜芦醇具有更加绿色环保的优势。

白藜芦醇的合成需要L-酪氨酸或L-苯丙氨酸作为前体，通过结合3分子的丙二酰辅酶A生成白藜芦醇。通过在微生物宿主中表达植物途径的白藜芦醇合成途径，已经实现了白藜芦醇的从头合成，但是产量较低，对于工业化规模生产较为困难。解脂亚洛酵母作为一种典型的非常规产油酵母，有着完整的遗传操作工具，并且还含有大量的乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A，是理想的白藜芦醇生产宿主。

发明内容

本发明提供了一种合成白藜芦醇的解脂亚洛酵母工程菌，以解脂亚洛酵母PO1f为出发菌株，在基因组上整合来源于Flavobacterium johnsoniae的酪氨酸解氨酶FjTAL，并表达来源于Petroselinum crispum的4-香豆酸辅酶A连接酶Pc4CL1和来源于Vitisvinifera的二苯乙烯合成酶VvSTS。

在一种实施方式中，所述解脂亚洛酵母Po1f公开于论文《Combining 26s rDNAand the Cre-loxP System for Iterative Gene Integration and Efficient MarkerCuration in Yarrowia lipolytica》。

在一种实施方式中，所述Pc4CL1和VvSTS通过质粒游离表达，或在基因组上整合表达。

在一种实施方式中，所述FjTAL由启动子TEFin启动并整合在D17位点。

在一种实施方式中，编码所述FjTAL的核苷酸序列如SEQ ID NO.l所示，所述启动子TEFin的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在一种实施方式中，所述工程菌还在F1-3位点整合表达了莽草酸途径基因YlARO1，解除了莽草酸反馈抑制的YlARO4^K221L与YlARO7^G139S基因，所述YlARO1、YlARO4^K221L和YlARO7^G139S的核苷酸序列如SEQ ID NO.5～7所示。

在一种实施方式中，编码所述Pc4CL1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述VvSTS核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述基因Pc4CL1和VvSTS由启动子TEFin启动，并在重组菌株中游离质粒表达；所述启动子TEFin的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。