[发明专利]一种降低眼压的表达NRP1的重组腺相关病毒的构建方法及其应用

说明书

本发明公开了一种降低眼压的表达NRP1的重组腺相关病毒的构建方法及其应用。本发明利用AAV为载体携带重组Neuropilin1基因，采用ICAM2血管内皮特异性启动子，构建得到AAV9‑ICAM2‑hNeuropilin1，该AAV9‑ICAM2‑hNeuropilin1作为基因治疗药物，对小鼠进行单次前房注射，可实现AAV载体介导的眼部Neuropilin1基因转导，促进Schlemm’scanal的形成，改善房水外排和降低眼压，可持续时间长且无明显毒副作用，适用于慢性青光眼的治疗。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种降低眼压的表达NRP1的重组腺相关病毒的构建方法及其应用。

背景技术

青光眼是由于视网膜神经节细胞受损而导致失明的一类视神经疾病。高眼压是青光眼的主要致病因素，降低眼压是治疗青光眼的关键，但现有的降眼压药物存在许多局限性，如拟副交感神经药、β-肾上腺能受体阻滞剂、肾上腺能受体激动剂和前列腺素衍生物等需要患者每日滴眼1～3次，不仅用药频繁，而且容易导致副作用。对于慢性青光眼患者，药物治疗存在局限性，通常需要结合手术治疗，如小梁切除术或巩膜分层切除等，但这些手段存在一定的手术风险，可能带来严重的后遗症。高眼压主要是由于房水循环系统发生异常而导致。房水由睫状突上皮细胞产生，通过瞳孔进入前房，再由前房角经过小梁网进入施累姆氏管(Schlemm’s canal)，最终汇入血液循环。Schlemm’s canal位于角膜缘处巩膜实质中，介导人眼中70-90％的房水外排。其功能障碍会导致房水外排阻滞，诱发眼压升高。

Schlemm’s canal由内皮细胞构成。在2014年，科学家首次证实小鼠Schlemm’scanal的发育始于角膜缘巩膜表层的血管内皮细胞以出芽方式迁移进入巩膜实质中，于出生后5天转分化成为Schlemm’s canal内皮细胞，随后Schlemm’s canal内皮细胞在巩膜中围绕角膜缘进行增殖延伸，至3周龄时结构发育完整。Neuropilin1在内皮细胞中高表达，与VEGF受体共同介导VEGF信号在内皮细胞中的传导。我们及其他许多学者的研究发现，Neuropilin1可通过促进内皮细胞迁移和细胞间连接而在内皮细胞所参与的众多生理进程中发挥重要作用。我们首次发现，内皮细胞Neuropilin1对促进Schlemm’s canal的形成、房水外排和降低眼压起重要作用。通过文献检索，尚未发现有关于Neuropilin1可通过促进Schlemm’s canal的形成以改善房水外排和降低眼压的文献报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何在降眼压的同时减少用药频率，延长药物作用的时间。为了解决以上技术问题，本发明提供了一种有效的降眼压基因治疗药物，以腺相关病毒(AAV)为载体携带重组Neuropilin1(NRP1)基因的制备方法及运用。

本发明的第一个目的是提供一种降低眼压的表达NRP1的重组腺相关病毒的构建方法，包括以下步骤：

1)获取如SEQ ID NO.1所示的人源性hNeuropilin1基因片段；

2)获取如SEQ ID NO.2所示的人源性ICAM2启动子序列；

3)构建如SEQ ID NO.3所示的ICAM2-hNeuropilin1片段；

4)构建pAAV-ICAM2-hNeuropilin1重组质粒；

5)AAV9-ICAM2-hNeuropilin1的包装、纯化和浓缩。

优选的，步骤1)中获取人源性hNeuropilin1基因片段的扩增引物为：hNeuropilin1 F:5'-TGGAGACTGCCAGAGATGGAGAGGGGGCTG-3'和hNeuropilin1 R:5'-TCATGCCTCCGAATAAGTACTCTGTGTATTC-3'。

优选的，步骤2)中获取人源性ICAM2启动子序列的扩增引物为：ICAM2 F: