[发明专利]一种多重定量PCR检测真菌的方法以及试剂盒

权利要求书

1.一种多重定量PCR检测真菌的试剂盒，其特征在于，其中包括有用于多重定量PCR反应对真菌进行检测的引物组合，所述的引物组合包括：

用于对烟曲霉进行进行检测的正反向引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示；

用于对新型隐球菌进行进行检测的正反向引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示；

用于对耶氏肺孢子菌进行烟曲霉进行检测的正反向引物对，核苷酸序列如SEQ IDNO.7-8所示；

用于对进行微小根毛霉进行检测的正反向引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.10-11所示。

2.根据权利要求1所述的多重定量PCR检测真菌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括分别对扩增产物进行报告的探针组合；所述的探针组合包括：

用于对烟曲霉扩增产物进行报告的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

用于对新型隐球菌扩增产物进行报告的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

用于对耶氏肺孢子菌扩增产物进行报告的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

用于对微小根毛霉扩增产物进行报告的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

3.根据权利要求1所述的多重定量PCR检测真菌的试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端修饰有报告基团，所述报告基团为FAM、HEX、ROX和Cy5；四种探针采用不同的报告基团修饰。

4.根据权利要求1所述的多重定量PCR检测真菌的试剂盒，其特征在于，所述探针的3’端修饰有淬灭基团，所述猝灭基团为BHQ1和BHQ2。

5.根据权利要求4所述的多重定量PCR检测真菌的试剂盒，其特征在于，SEQ ID NO.3所示核苷酸序列与SEQ ID NO.6所示核苷酸序列采用淬灭基团BHQ1修饰，SEQ ID NO.9所示核苷酸序列与SEQ ID NO.12所示核苷酸序列采用淬灭基团BHQ2修饰。

6.一种多重定量PCR检测真菌的方法，其特征在于，其采用上述的试剂盒进行多重定量PCR反应对烟曲霉、新型隐球菌、耶氏肺孢子菌和微小根毛霉进行鉴定。

7.根据权利要求6所述的多重定量PCR检测真菌的方法，其特征在于，所述的方法中，还包括对样本进行多重PCR反应的步骤。

8.根据权利要求6所述的多重定量PCR检测真菌的方法，其特征在于，所述的样本包括但不限于肺泡灌洗液、痰液、血液、脑脊液、心包积液、胸水、尿液、脓液、拭子和组织等。

9.根据权利要求6所述的多重定量PCR检测真菌的方法，其特征在于，多重定量PCR反应中的试剂包括：2×Hieff Universal TaqMan multiplex qPCR master mix 12.5μL，Primer Mix(10uM)的终浓度为0.2μM，Probe Mix(10uM)的终浓度为0.1μM，10ng/μL的DNA模板1μL，无酶水补充25μL。

10.根据权利要求6所述的多重定量PCR检测真菌的方法，其特征在于，所述多重定量PCR扩增的反应程序为95℃预变性5min；95℃变性15s；58.5℃退火30s；扩增40个循环；所述的方法中，如果FAM荧光修饰探针有明显的S型扩增曲线时，说明待检样本中存在烟曲霉；如果HEX荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct＜40说明待检样本中存在新型隐球菌；如果ROX荧光修饰探针有明显的S型扩增曲线时，说明待检样本中存在耶氏肺孢子菌；如果Cy5荧光修饰探针有明显的S型扩增曲线时，说明待检样本中存在微小根毛霉。