[发明专利]枣树novel-miR16和靶基因ZjTCP4的应用

说明书

本发明提供了枣树novel‑miR16和靶基因ZjTCP4的应用。RT‑qPCR分析表明，amiRNA‑miR16过表达的转基因植株中novel‑miR16的表达量较对照可提高1.3‑5.25倍，并且过表达novel‑miR16可提高转基因烟草对干旱胁迫的抗性。amiRNA技术能够在烟草中高效表达枣树novel‑miR16，novel‑miR16正调控枣树的抗旱性。

技术领域

本发明属于枣树分子生物学领域，具体涉及枣树novel-miR16和靶基因ZjTCP4的应用。

背景技术

枣(Ziziphus jujuba Mill.)为鼠李科(Rhamnaceae)枣属(Ziziphus Mill.)植物，原产我国，是中国重要的特色优势果树树种之一，全国除黑龙江省无枣树外，其余各地均有枣树生长；枣树在我国有悠久的栽培历史，追溯得知早在7000多年前的新石器时代就有栽培；其资源丰富，目前枣树有900多个品种，已经审定认定了210个品种。枣树是防风固沙的“急先锋”，在改良荒滩、水土保持、改善生态环境方面发挥着重要作用。随着枣树栽培区的不断变化迁移，特别是“东枣西移”沙漠和戈壁区之后，枣树在高光热资源、低降雨的环境下其生存环境发生了较大变化。沙漠和戈壁的一些枣园采用传统的沟灌或管灌。水资源利用模式不合理，水资源利用效率低，有限的水资源没有得到充分利用，枣树的潜力没有得到充分利用。枣树在生产过程中普遍存在严重的裂果问题，造成了极大的经济损失。降雨、灌溉引起的枣园空气湿度大幅度变化都可导致裂果。如果枣果在生长前期较干旱，当它接近成熟或在成熟阶段，受到暴雨或过度灌溉时果肉生长迅速，就会加重裂果。目前，主栽的枣树品种分化和退化现象严重，远远不能满足人们的需求。因此，深入开展枣树抗旱品种的选育工作刻不容缓。由于枣树花小、人工去雄困难、坐果率低且胚败育现象严重，使得枣树杂交育种非常困难，所以生物技术育种是枣树未来育种的主要途径。

miRNA是一类非编码小分子调控RNA，通常在转录后水平调控靶基因的表达。越来越多的研究表明，miRNA在调控植物干旱胁迫反应中发挥着重要的调控作用。本发明在前期甘肃沿黄灌区枣树引种试验的基础上，选择干旱敏感型枣树品种‘冬枣’和耐旱型枣树品种‘赞皇大枣’为实验材料，通过small RNA-seq和降解组测序技术在枣树全基因组水平挖掘干旱相关的miRNAs及其调控的靶基因，通过筛选关键miRNAs并构建超强表达载体转化烟草获得转基因的植株，通过对转基因植株的抗旱性分析，解析miRNA调控枣树响应干旱胁迫的分子机理。为有目的地利用miRNA进行枣树分子育种提供候选资源，也为其他作物的抗旱性育种提供了一定的理论基础。现有技术中还未见枣树novel-miR16及其靶基因ZjTCP4的应用的相关报道。

发明内容

本发明要解决的关键技术问题在于提供枣树novel-miR16和靶基因ZjTCP4的应用。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

1.枣树novel-miR16前体序列如序列表SEQ No.1所示；枣树novel-miR16成熟序列如序列表SEQ No.2所示，ZjTCP4转录本序列如序列表SEQ No.3所示。

2.枣树干旱相关的miRNAs的鉴定方法，包括：(1)植物材料、数据库软件、主要仪器选择，(2)材料处理，(3)总RNA的提取及检测，(4)小分子RNA文库的构建及测序，(5)测序数据的生物信息学分析，(6)保守miRNAs的鉴定，(7)枣树新miRNAs的生物信息学鉴定，(8)枣树miRNAs的差异表达分析，(9)靶基因预测与注释，(10)干旱相关miRNA的RT-qPCR验证：

3.枣树干旱相关的miRNAs，包括：干旱胁迫下调表达的novel-miR113和novel-miR250，干旱胁迫上调表达的novel-miR3、novel-miR16、novel-miR209、novel-miR288、novel-miR340、novel-miR345。