[发明专利]一种特异性靶向大肠杆菌STBL3的endA基因的gRNA及其应用

说明书

本发明提供了一种特异性靶向大肠杆菌STBL3的endA基因的gRNA及其应用。所述gRNA包括SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列。本发明所述靶向大肠杆菌STBL3的endA基因的gRNA特异性好，脱靶率低，可以实现endA基因的特异性敲除，敲除效率高，应用价值高。本发明还提供了一种endA基因编辑系统，本发明所述endA基因编辑系统具有敲除基因组中endA基因的能力，通过所述gRNA和Cas9的配合，具有大片段敲除的能力，编辑效率更高。

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种特异性靶向大肠杆菌STBL3的endA基因的gRNA及其应用。

背景技术

大肠杆菌感受态STBL3是endA⁺型菌株，endA基因编码非特异性核酸内切酶I(Endonuclease I，Endo I)，可以非特异性降解双链DNA。STBL3菌株来源于HB101 E.colistrain，是慢病毒载体系统推荐使用的菌株，基因组含有重组酶recA13突变，可有效抑制长片段末端重复区的重组，降低错误重组的概率；但不含核酸酶endA1突变，在细菌直接测序的过程中，随着细菌的裂解，细胞周质中的Endo I会释放出来，降解滚环扩增(rollingcircle amplification，RCA)过程中的产物，导致测序结果不稳定。

细菌直接测序利用phi29 DNA聚合酶和随机六聚体引物对环状模板(菌液)进行滚环扩增，以获得供测序的DNA。在测序过程中发现，以STBL3等endA⁺型菌株为宿主菌的样品，测序结果失败的概率很大。但是STBL3有特定的克隆构建优势，因此很多情况下没有可替代的感受态。

研究人员尝试优化RCA流程发现，提升菌液浓度、延长菌体裂解时间、延长等温扩增时间、使用蛋白酶K抑制Endo I均不能很好地改善测序结果。生产上目前只能通过对菌液进行质粒抽提后测序。

现有技术不能从根源上解决以STBL3为宿主菌的样品测序困难的问题，不管是提升菌体量(模板量)还是延长反应时间，都会增加时间成本，而使用蛋白酶K不仅增加了生产成本还导致了操纵的复杂性。而抽提质粒后测序更是大大增加了工作量，违背了初衷(又快又准)。因此，提供一种能够用于细菌直接测序的STBL3宿主菌在克隆构建中具有重要的应用价值。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种特异性靶向大肠杆菌STBL3的endA基因的gRNA及其应用。本发明利用CRISPR/CAS9基因编辑技术，敲除STBL3菌株的endA基因，使得STBL3菌株也可以像其他菌株一样进行直接测序，有效提高了STBL3菌株利用菌液直接测序的稳定性和准确性。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种特异性靶向大肠杆菌STBL3的endA基因的gRNA，所述gRNA包括SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列。

本发明所述靶向大肠杆菌STBL3的endA基因的gRNA特异性好，脱靶率低，可以实现cendA基因的特异性敲除，敲除效率高，应用价值高。所述gRNA将endA基因第82位氨基酸W及其之后的序列删除，使编辑后的endA基因失去相应的生物学功能，从而实现endA基因的敲除。

第二方面，本发明提供一种endA基因编辑系统，所述基因编辑系统包括第一方面所述的特异性靶向大肠杆菌STBL3的endA基因的gRNA和Cas9。

本发明所述endA基因编辑系统具有敲除基因组中endA基因的能力，通过所述gRNA和Cas9的配合，具有大片段敲除的能力。

优选地，所述endA基因编辑系统还包括供体质粒。

优选地，所述供体质粒包括修复模板endA-HA。