[发明专利]一种靶向改造Expi293细胞外泌体递送siMMP13的方法

说明书

本发明公开了一种靶向多肽修饰Expi293细胞外泌体靶向软骨细胞递送siMMP13的方法，包括以下步骤：分离纯化Expi293细胞外泌体，Expi293细胞外泌体标记，将DSPE‑CAP多肽与Expi293细胞外泌体进行靶向偶联，然后通过电穿孔将siMMP13负载到靶向改造后的Expi293细胞外泌体中。本发明通过化学修饰方案靶向改造Expi293细胞外泌体递送siMMP13，制备方法简单，靶向性高，具有良好的受损部位聚集效果，实现高效的药物释放，靶向递送siMMP13能抑制软骨基质代谢分解，从而抑制骨性关节进展，是一种安全性高，靶向性高，适用范围广的药物运载体系。

技术领域

本发明涉及一种外泌体靶向改造的方法，具体而言，是一种靶向改造Expi293细胞外泌体递送siMMP13的方法。

背景技术

外泌体是一种可由多种细胞分泌的膜性小泡，其直径在30-150nm之间，内容物为多种非编码RNA，蛋白和核酸等，通过与受体细胞结合释放内容物发挥不同的生物学功能。外泌体在体内性质稳定且半衰期长，可以穿越生物屏障到达靶细胞，以不同的方式被受体细胞摄取，作为生物标志物或药物运输载体发挥作用，亦可与传统的病毒载体结合使用，形成一种功能更强的基因治疗工具。作为外泌体的供体细胞，Expi293细胞增殖周期短，可无血清高密度悬浮培养，能够大量稳定提供外泌体以满足临床试验的需要。

基质金属蛋白酶13(MMP13)是Ⅱ型胶原蛋白裂解的关键酶，参与软骨降解的主要分解代谢因子。使用针对MMP13的siRNA进行关节组织原位注射，减少了关节组织中MMP13蛋白的产生和促炎基因表达，从而抑制了关节软骨退化和骨赘的形成，达到治疗骨关节炎的效果。

CN113018265A提供了一种靶向外泌体包裹miRNA-140在治疗骨关节炎药物中的方法。其通过将CAP-lamp2b重组质粒转染进小鼠树枝状细胞以得到靶向软骨的外泌体，并通过电穿孔方法将miRNA-140包裹到靶向外泌体中。然而，细胞工程获得的靶向外泌体，对细胞培养技术、设备要求高，制作工序繁多，耗时较长。CN113274421A公开了一种膝关节治疗用抗炎型外泌体制剂及制备方法和应用。然而体外培养的脂肪间充质干细胞发生衰老或分化时，由此而来的外泌体也会发生相应的功能降低。此外，贴壁细胞的培养成本高，外泌体的产量低，且存在细胞培养过程中血清污染的可能。

发明内容

基于上述背景技术，本发明所要解决的技术问题在于提供一种靶向改造Expi293细胞外泌体递送siMMP13的方法，即利用二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)作为一种脂质可以插入外泌体的脂双层膜中的性质，把亲和肽(CAP)脂质多肽插入到外泌体膜表面，建立一种Expi293细胞外泌体体系，使其具有软骨靶向递送作用。

本发明第一方面提供一种靶向改造Expi293细胞外泌体的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)制备DSPE-CAP：连接DSPE和对软骨细胞具有靶向作用的亲和肽CAP；

(2)制备靶向软骨细胞的外泌体DSPE-CAP-Exo：将Expi293细胞外泌体与步骤(1)所述DSPE-CAP孵育，收集靶向软骨细胞的外泌体DSPE-CAP-Exo组分。

所述亲和肽CAP具有如DWRVIIPPRPSAC所示的序列。

优选地，在步骤(1)之前还可包括步骤(a)Expi293细胞外泌体提取及表征；

优选地，所述步骤(a)具体包括：从Expi293细胞获取Expi293细胞外泌体；

优选地，步骤(2)具体包括：将Expi293细胞外泌体与步骤(1)所述DSPE-CAP孵育，通过SEC柱子去掉未结合到外泌体膜上的DSPE-CAP多肽，收集4-12组分的液体得到靶向软骨细胞的外泌体；

优选地，所述孵育的PH为7-9，更优选为8；