[发明专利]一种用于体细胞重编程为多巴胺神经元的培养基、试剂盒和培养方法

说明书

本发明提供了一种用于体细胞重编程为多巴胺神经元的培养基、试剂盒和培养方法，属于细胞技术领域。本发明相对于现有技术省略多个转录因子的情况下，使用单一miR‑34b结合诱导培养基和成熟培养基开发一种高效率重编程人和鼠体细胞为多巴胺神经元的方法。本发明利用microRNA不会整合到基因组上消除转录因子可能的基因组整合和插入突变的潜在风险，而且利用优化的重编程诱导培养基可提高多巴胺神经元的生成效率、缩短产生时间以及加快神经元的成熟，为细胞疗法治疗帕金森病等神经退行性疾病提供了细胞基础。

技术领域

本发明属于细胞技术领域，具体涉及一种用于体细胞重编程为多巴胺神经元的培养基、试剂盒和培养方法。

背景技术

帕金森病(Parkinson disease，PD)是一种以运动和非运动症状为特征的进行性神经退行性疾病，主要病理表现为黑质纹状体中多巴胺能神经元的丧失，其典型临床症状为运动迟缓、肌强直、震颤及一系列自主神经、认知功能障碍等^[1]。

当前PD的治疗措施包括药物及手术治疗，药物治疗的疗效随疾病进展而消失^[2]。手术深部脑刺激(deep brain stimulation，DBS)是治疗PD的最常见和有效的手术方法，但不能阻止步态/平衡障碍和痴呆的进展^[3]。目前，基于干细胞生物学蓬勃发展，细胞替代疗法应运而生。通过移植细胞来替代受损的多巴胺神经元恢复细胞功能在治疗PD症状方面具有巨大潜力^[4]。目前，研究使用的细胞类型主要有胚胎干细胞、诱导多能干细胞(IPS)及其诱导分化的神经干细胞和多巴胺神经元，以及胚胎来源的神经干细胞。但胚胎干细胞和胚胎来源的神经干细胞存在细胞来源不足、免疫排斥以及伦理学等问题。而诱导多能干细胞IPS来源于患者的皮肤组织或者血液细胞，可以直接分化形成多巴胺神经元，不存在免疫排斥问题，但存在潜在的致瘤风险。

直接细胞重编程作为一种新技术在再生医学领域具有重要的应用和发展前景，该方法可使一种成熟细胞在所需组织中原位转化为另一种成熟细胞，不需经过神经干细胞(induced neural stem cells，iNSCs)或诱导多能干细胞(iPSCs)的过程，能够克服iPSCs治疗PD的局限性，为治疗PD提供了新的方向。通过使用转录因子结合慢病毒载体，导入到成纤维细胞中进行直接重编程可制备多巴胺神经元的方法，可以很好的解决IPS的潜在致瘤性，但是外源转录因子的插入可能会引起基因组的不可控的突变，导致对临床应用价值的使用限制。

2011年，Pfisterer等^[5]通过在慢病毒载体中过表达三种转录因子ASCL1、BRN2和MYT1L与两个基因FOXA2和LMX1A，首次将人胚胎和出生后成纤维细胞直接重编程为功能性多巴胺神经细胞(iDNs)，但效率较低，TH⁺的iDNs只占Tuj1⁺的神经元总数的10％左右。

miRNA是一类长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA，其可作为基因表达的转录后调节因子^[6]。它们在大脑发育方面有着至关重要的作用，例如神经形成、神经元成熟、突触形成、轴突导向和神经元可塑性^[7]。miRNA不改变基因组且不引发致瘤性，其进行细胞重编程时不存在小分子化合物的毒性和外源基因的参与。既往研究证明，miRNA的特异性缺失，导致中脑iDNs进行性丢失^[8]，证明miRNA在中脑iDNs形成、存活和功能中起关键作用。Gregorio等^[9]使用miR-34b/c结合两种转录因子ASCL1、NURR1可将成纤维细胞直接重编程为iDNs，其与人类中脑DA神经元的电生理特性一致，效率为19.5％。结果表明miR-34b/c可调节Wnt1信号通路的表达，促进细胞周期退出并诱导多巴胺(DA)分化，miR-34b/c使转分化的效率加倍。因此，miRNA与关键转录因子具备联合作用，可增强iDNs体外生成的能力。