[发明专利]一种耐热葡萄糖氧化酶突变体及其应用

说明书

一种耐热葡萄糖氧化酶突变体及其应用，其特征在于，包括以葡萄糖氧化酶PaGOD‑1GPE为母本对A263和K424两个位点突变后得到的突变体，命名为PaGOD‑1GPE_A263P和PaGOD‑1GPE_K424F；所述PaGOD‑1GPE_A263P的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述PaGOD‑1GPE_K424F的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。相对于盲目筛菌或人工（自然）诱变等手段，理性设计缩短了酶学性质改造时间。因此，将本发明的耐热葡萄糖氧化酶突变体应用于饲料添加产业中，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及基因工程和蛋白质工程领域，涉及一种来源于真菌P.amagasakiense的葡萄糖氧化酶PaGOD-1GPE突变体及其应用。

背景技术

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)是一种需氧脱氢酶，能专一地氧化β-D-葡萄糖成为葡萄糖酸和过氧化氢。葡萄糖氧化酶广泛分布于动植物和微生物体内，微生物是其主要来源，主要生产菌株为黑曲霉和青霉。葡萄糖氧化酶作为替代抗生素的新型饲料酶制剂，具有保护动物肠道，促进消化吸收，提高机体免疫力等多种功能。产自特异青霉和黑曲霉的葡萄糖氧化酶已被列入农业部《饲料添加剂品种目录(2013)》第4大类酶制剂。

Pen-GOD以同型二聚体的形式存在，每个亚基可非共价结合一个FAD。对β-D-葡萄糖专一性较强，通常来源于青霉属比来源于曲霉属的GOD对底物的催化效率更高，大多数GOD在30 50℃和pH 6.0的条件下表现出最大的酶活性，但是稳定性较差。目前，大多数GOD在pH 4.0 7.0的缓冲条件下可以维持稳定，当pH值小于3.0或高于10.0时，基本没有酶活。青霉属来源的GOD一般在50℃以下维持稳定。

葡萄糖氧化酶的应用十分广泛，主要包括饲料、食品、医药、纺织和生物燃料电池。在工业应用中，大多数应用环境都属于高温环境，因此获得热稳定性优良的葡萄糖氧化酶对工业生产至关重要。

目前，蛋白质工程在酶分子改良方面应用广泛，即通过对基因或者蛋白本身进行修改或修饰以改变蛋白结构从而实现酶功能的改造。蛋白质工程主要用于酶的热稳定性、催化效率、底物特异性和极端环境耐受性等酶学性质的设计和改造。主要涉及的方法有定向进化、理性设计和半理性设计。其中理性设计是一种快速且有效的改造手段，如通过该方法，将A.niger和P.amagasakiense来源的GOD基因进行相互替换，成功获得催化效率和稳定性均提高的GOD突变体。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供一种葡萄糖氧化酶突变体及其应用，通过对Penicillium amagasakiense来源的PaGOD-1GPE关键氨基酸位点A263和K424突变后筛选得到的突变体，具体得到2种热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体，对于应用到饲料防霉和替代抗生素产业中具有广阔的前景。

技术方案：一种耐高温葡萄糖氧化酶突变体，包括以葡萄糖氧化酶PaGOD-1GPE为母本对A263和K424两个位点突变后得到的突变体，命名为PaGOD-1GPE_A263P和PaGOD-1GPE_K424F；所述PaGOD-1GPE_A263P的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述PaGOD-1GPE_K424F的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

翻译上述葡萄糖氧化酶突变体的核苷酸，所述PaGOD-1GPE_A263P的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述PaGOD-1GPE_K424F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示

一种重组载体，所述重组载体包括上述的核苷酸序列。

一种重组菌株，含有上述重组载体。

上述重组菌株在制备饲料添加剂中的应用。

上述重组菌株在抑制病原微生物中的应用。