[发明专利]犬成体干细胞活性因子及滴眼液的制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种犬成体干细胞活性因子及滴眼液的制备方法和应用。为进一步开发犬脂肪间充质干细胞的应用，延长有效保存时间，提高角膜损伤愈合的速度、本发明用的低传代的间充质干细胞（5代左右），其分泌的活性成分多，采用专用的无血清培养基制备，比其他犬成体干细胞活性因子比起来没有免疫排斥和副作用。本发明方法为：1）用α‑MEM完全培养液培养传代从组织中分离的犬脂肪间充质干细胞；2）当细胞生长密度到80~90％时，收集低传代犬脂肪间充质干细胞培养上清液，将收集的上清液无菌离心，弃沉淀取上清液，上清液超低温‑80℃冻存备用；3）将‑80℃冻存的凝固体通过冷冻干燥机蒸发水分获取干粉，真空压力0.030 mbar、‑88℃、48 h制得的犬成体干细胞活性因子。

技术领域

本发明涉及生物干细胞技术领域在宠物眼科的应用，具体涉及一种犬成体干细胞活性因子及滴眼液的制备方法和应用。

背景技术

犬猫因角膜损伤而导致的泪目、眼分泌物增多、羞光、瘢痕组织修复困难等问题是宠物临床的常见问题，角膜损伤未能及时治疗修复而形成的瘢痕组织使宠物的视力大大减弱，而角膜损伤修复目前还未有十分有效的治疗方案。宠物使用阿托品、红霉素等滴眼液的宠物在停药后，炎症、溃疡症状会出现反弹，表现为角膜炎进展。而且阿托品/红霉素等滴眼液有很高的全身和局部不良反应发生率。因此亟需寻找更适合的眼部用药，以预防近视。

间充质成体干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)，是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，间充质干细胞用于组织修复或再生是近十年的研究热点，间充质干细胞分泌大量活性物质，包括生长因子(Growth Factor)、细胞因子(Cytokine)和趋化因子(Chemokine)、抗纤维化因子等，在损伤组织的修复过程中发挥重要作用，可促进细胞分裂，调节细胞代谢，影响细胞的形态、浸润、分化和衰老，对角膜的上皮细胞基质细胞核内皮细胞均可产生影响。因此，通过培养犬脂肪间充质干细胞，分离细胞培养上清液，并添加相关辅料等配制犬间充质干细胞因子滴眼液，并观察其对犬猫角膜损伤的修复效果。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种犬成体干细胞活性因子及滴眼液的制备方法和应用，为进一步开发犬脂肪间充质干细胞的应用，延长有效保存时间，提高角膜损伤愈合的速度、本发明用的低传代的间充质干细胞(5代左右)，其分泌的活性成分多，采用专用的无血清培养基制备，比其他犬成体干细胞活性因子比起来没有免疫排斥和副作用。

为解决现有技术存在的问题，本发明的技术方案是：犬成体干细胞活性因子的制备方法步骤为：

1)用α-MEM完全培养液培养传代从组织中分离的犬脂肪间充质干细胞；

2)当细胞生长密度到80～90％时，收集低传代犬脂肪间充质干细胞培养上清液，将收集的上清液无菌离心，弃沉淀取上清液，上清液超低温-80℃冻存备用；

3)将-80℃冻存的凝固体通过冷冻干燥机蒸发水分获取干粉，真空压力0.030mbar、-88℃、48h制得的犬成体干细胞活性因子，称重，锡纸包裹。

步骤1)的具体方法为：

(1)将组织块在α-MEM中清洗，剪碎至1mm³的碎末状；

(2)吸取预先配好过滤后37℃预热的0.1％的I型胶原酶反复吹吸，最后全部吸入含胶原酶的50mL离心管中；

(3)将离心管管口用喷洒过酒精的封口膜封口后，将其置于37℃恒温水浴振荡器中消化1h，每隔10min上下反复颠倒离心管；

(4)1h后，用等量α-MEM培养液中和胶原酶，反复吹吸使其完全中和后1000rpm，5min离心，用来分离成熟的脂肪组织；

(5)弃去上层悬液及上浮的白色脂肪，用20mLα-MEM细胞培养液冲起，吹打均匀后，经100μm滤网过滤后1000rpm，5min常温离心；