[发明专利]β2-GP1包被磁珠的制备方法及其制备的磁珠与应用

说明书

本发明涉及免疫学领域，尤其涉及β2‑GP1包被磁珠的制备方法及其制备的磁珠与应用。本发明提供了抗β2糖蛋白1磁微粒化学发光免疫检测试剂盒。本发明研究了β2‑GP1构像改变以及固相化的最佳条件，通过研究β2‑GP1的最佳变构条件，在不引入其他物质的情况下将变构过程和包被过程合二为一，彼此互相支持，存在相互作用。可提高效率，降低成本，同时提高检测灵敏度。可直接将天然的β2‑GP1抗原变构后稳定的连接至磁微粒上，无需进行透析、分离纯化等复杂的工艺，方便快捷且无损耗，不引入其他物质，减少干扰，减少成本。相对天然和重组抗原，本发明的方法特异性更强、灵敏度更高，稳定性更好，具有良好的临床应用前景。

技术领域

本发明涉及免疫学领域，尤其涉及β2-GP1包被磁珠的制备方法及其制备的磁珠与应用。

背景技术

抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome，APS)是一种以反复动静脉血栓形成，病态妊娠(通常为多次不明原因流产)、血小板减少等为主要临床表现的自身免疫性疾病。APS的主要临床表征是动静脉血栓的形成，而血栓在许多其他疾病中也普遍存在，因此APS的诊断依赖抗磷脂抗体(antiphospholipid-antibody,aPL)的检测。抗β2糖蛋白1抗体(anti-beta2 glycoprotein 1，aβ2-GP1)是最主要的标志物之一。但是由于其极度异质性，不同厂家商品化试剂盒的检测差异，影响临床医师的判断，对临床诊断带来了一定的困扰。

β2糖蛋白1(β2-GP1)，又称为载脂蛋白H(Apolipoprotein H，APOH)，在人类中由APOH基因编码,定位于染色体17q23-24。它是一种由肝细胞合成的糖蛋白，其分子量为50kD左右，在血液循环中以游离形式存在，浓度约为150～300μg/mL。β2-GP1由5个结构域(Domain 1～5)构成，每个结构域为短的重复序列片段(short consensus repeat，SCR)，符合补体调节蛋白(complement control protein，CCP)的结构模型，为保守的CCP序列。由Cys-Pro残基进行连接，其Cys残基在cys1-3和cys2-4之间形成二硫键。DomainⅤ额外含有一个二硫键和C端的残基，其带正电荷氨基酸序列(Lys282-Asn-Lys-Glu-Lys-Lys287)为与阴离子磷脂进行结合的主要位点。

在正常人体内(生理状态下)β2-GP1的Domain1与Domain 5相连接，呈现环状闭合状态(O型)。在APS患者体内(病理状态下)，β2-GP1带正电荷的Domain 5与带负电荷的磷脂结合，呈现出打开状态(J型)。此时，抗原表位暴露，可与抗β2-GP1抗体结合。β2-GP1从闭合状态变构为打开状态是一个可逆的过程，且不同的条件下，变构程度也不一致，如果β2-GP1的构像未完全打开，会影响与一些抗体的结合，导致漏检。

目前抗β2-GP1抗体的检测方法主要有酶联免疫吸附法(ELISA)、磁微粒化学发光法(CLIA)、荧光酶免疫法(FEIA)和多重微珠免疫法等。这些方法的检测原理均为间接法检测抗体，即固相化的β2-GP1抗原特异性结合样本中的抗β2-GP1抗体，再连接辣根过氧化物酶(HRP)/碱性磷酸酶(AP)或者吖啶酯标记的动物源抗人IgG/IgM/IgA抗体(标记二抗)。

再次使用清洗液洗去游离物质，加入底物，底物被催化或者直接发光，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据吸光或者发光值来进行定性或定量分析。

影响抗β2-GP1抗体检测的最主要因素是β2-GP1抗原的固相化。

目前有两种包被方式：一、直接将天然或者重组的β2-GP1抗原固相化；二、将天然β2-GP1抗原预处理后(变构后)再进行固相化。

第一种：将天然或者重组的β2-GP1抗原被动吸附到96孔微孔板上或者化学连接到磁微粒上。