[发明专利]一种ZmMIR398b-pro的应用

权利要求书

1.一种ZmMIR398b-pro的应用，其特征在于，应用于在热诱导时启动目的基因表达，所述目的基因的DNA序列与ZmMIR398b-pro核苷酸序列的3'末端相连；其中，对玉米进行热诱导的方法包括：

利用T-DNA插入转基因技术构建了包含ZmMIR398b启动子融合GUS基因的表达载体及转基因植物，PCR扩增ZmMIR398b promoter核苷酸序列，并使用BamH I和NcoI双酶切PCR产物后，将ZmMIR398b启动子构建到目的载体pCAMBIA3301-GUS中，其中，ZmMIR398b启动子用于在热诱导条件下GUS基因表达，ZmMIR398b启动子的3’端与GUS基因的上游序列连接；

通过农杆菌EHA105株系将pCAMBIA3301-ZmMIR398b promoter-GUS过表达载体转入玉米自交系C01的不成熟胚中得到多个转基因事件；

通过GUS组织化学染色的方法鉴定ZmMIR398b promoter在玉米热诱导过程中的作用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，还包括调控玉米耐热性的方法：

利用T-DNA插入转基因技术构建了包含两个串联重复发卡结构的ZmmiR398基因过表达载体及转基因植物，用PCR方法将ZmmiR398成熟核苷酸序列克隆并构建至pOT2-Polycis-UN载体，进一步将ZmmiR398构建到目的载体pZZ00026-PM中，得到ZmmiR398过表达载体；

通过农杆菌EHA105株系将ZmmiR398过表达载体转入玉米自交系C01的不成熟胚中得到多个转基因事件；

对多个转基因事件分别通过Northern blot的方法鉴定ZmmiR398基因在叶片中表达量升高的独立事件，得到调控玉米耐热性的事件。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，使用引物PCR扩增ZmMIR398bpromoter核苷酸序列时使用的引物为：MIR398b-p-F6和MIR398b-p-R4。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，MIR398b-p-F6为gagctcggtacccggggatccATGATGTCATGCAGTGA GG TGTCA。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，MIR398b-p-R4为ttaccctcagatctaccatggGCCGGAACTGCCTTTGCG。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，发卡结构的ZmmiR398过表达载体包括：使用玉米泛素基因UBI驱动的人工miRNA结构和使用增强CaMV 35S启动子驱动的BAR基因结构。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述利用T-DNA插入转基因技术构建了两个串联重复的发卡结构的ZmmiR398过表达载体，包括：

在pOT2-Polycis-UN载体中，将两个串联重复的具有发卡结构的ZmmiR398克隆到玉米泛素基因UBI启动子下游主干中。

8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，还包括：

对发卡结构的ZmmiR398过表达载体进行测序验证，并将所得的pOT2-Polycis-UN-miR398载体及目的载体pZZ00026-PM经PacI和MluI限制性内切酶进行双重消化；

将消化后回收的UBI-miR398-NOS片段克隆到pZZ00026-PM的二元载体中；

将经sanger测序验证的二元载体导入农杆菌菌株EHA105。