[发明专利]Sal作为m6A RNA甲基化修饰的促进剂的应用

说明书

Sal作为m6A RNA甲基化修饰的促进剂的应用，属于RNA表观遗传修饰领域。Salsolinol(Sal)是一种儿茶酚异喹啉类化合物，可能作为神经毒素在帕金森病的发生发展中发挥作用。本发明公开了Sal作为表观遗传调节剂的新用途，通过抑制m6A去甲基化酶FTO和ALKBH5的表达，上调多巴胺能神经细胞中m6A RNA甲基化修饰水平；并且Sal对FTO和ALKBH5产生抑制作用具有一定浓度依赖性，200μM时达到显著抑制作用。本研究揭示了Sal作为多巴胺能神经细胞m6ARNA甲基化修饰的促进剂，为表观遗传修饰在帕金森病中的研究提供借鉴。

技术领域

本发明属于RNA表观遗传修饰领域，具体涉及儿茶酚异喹啉类化合物Salsolinol能够促进多巴胺能神经细胞总RNA和mRNA上发生N6-腺苷酸甲基化修饰(m6A)。

背景技术

m6ARNA甲基化修饰是指在核糖核苷酸腺嘌呤碱基(A)的6号氮原子形成6-甲基腺嘌呤(m6A)，在真核生物mRNA甲基化修饰中占比超80％。在RNA甲基化酶(METTL3/METTL14/WTAP等)和去甲基化酶(FTO/ALKBH5)的作用下，m6A RNA甲基化修饰可实现动态可逆调节，并通过m6A识别蛋白(Readers)调控RNA的剪切、稳定性和翻译等发挥生物学功能。目前已发现的m6A促进剂主要通过与去甲基化酶竞争结合m6A从而抑制其去甲基化酶活性，如：恩他卡朋(Entacapone)通过与FTO蛋白直接结合抑制其去甲基化酶活性；IOX1是2OG氧合酶的一种广谱抑制剂，用于抑制ALKBH5，但具体机制尚不明确。

Salsolinol(1-甲基-4-苯基-1,2,3,4-四氢异喹啉，Sal)又称去甲猪毛菜碱，是一种儿茶酚异喹啉类化合物(CTIQs)。Sal及其衍生物N-甲基-Salsolinol(NM-Sal)与帕金森病(Parkinson’s disease,PD)环境毒素MPTP结构类似，体外研究中，Sal可以增加细胞内的氧化应激水平，加剧活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成，导致线粒体功能紊乱；向鼠脑纹状体区注射NM-Sal可以显著引起多巴胺能神经元的选择性缺失。这些证据表明Sal及其衍生物可能参与了PD的发生发展，因此受到人们广泛关注。研究显示，RNA表观遗传修饰可能参与PD的调控，然而，目前尚未有关于Sal在RNA表观遗传学修饰方面的研究报道。

发明内容

本研究是发现去甲猪毛菜碱是一种可以促进多巴胺能神经细胞中m6A RNA甲基化修饰的小分子化合物。研究显示，Sal通过抑制m6A去甲基化酶FTO和ALKBH5的启动子活性从而抑制其表达，进而上调多巴胺能神经细胞(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞，PC12)中m6A RNA甲基化修饰水平。

去甲猪毛菜碱作为m6A RNA甲基化修饰的促进剂的应用的研究步骤和效果表达如下：(1)将Sal溶于PBS中，然后加入细胞(多巴胺能神经细胞)，Sal在浓度为200μM时可显著抑制去甲基化酶FTO和ALKBH5在mRNA水平和蛋白水平的表达(图1)；一般浓度越大效果越好。

(2)对步骤(1)中经200μM Sal处理的多巴胺能神经细胞中的总RNA和mRNA进行提取，采用Dot-Blot的方法对m6A水平进行检测。首先采用亚甲基蓝染色结果证明RNA样品通过点样，成功附着于硝酸纤维膜(NC膜)上，然后采用m6A抗体进行免疫杂交，结果表明，Sal上调了总RNA和总mRNA中m6A含量(图2)。

(3)调取FTO和ALKBH5两种去甲基化酶的启动子序列(图3)并通过分子生物学方法将其连接到pGL3-Basic质粒中。pGL3-Basic质粒中具有荧光素酶(Firefly luciferase)的表达序列，将转录调控元件即FTO或ALKBH5的启动子序列插入到表达荧光素酶基因序列的前端，分别构建pGL3-FTO-promoter和pGL3-ALKBH5-promoter两种质粒，质粒结构如图4所示。