[发明专利]一种促进体外培养细胞生成外泌体的培养基及其诱导方法

权利要求书

1.一种促进体外培养细胞生成外泌体的培养基，其特征在于，每L培养基包括如下重量的组分：L-天冬酰胺7-8mg、L-谷氨酰胺360-370mg、D-葡萄糖900-1100mg、次黄嘌呤钠1.5-3mg、亚油酸0.03-0.05mg、硫辛酸0.05-0.15mg、生物素0.003-0.004mg、氯化胆碱8-10mg、烟酰胺1.5-2.5mg、盐酸吡哆醇1.5-2.5mg、腐胺0.07-0.09mg、丙酮酸钠50-60mg、胸腺嘧啶0.3-0.5mg、碳酸氢钠2300-2500mg、磷酸氢二钠65-75mg、磷酸二氢钠57-67mg、苯酚红7-9mg、氯化物7400-7600mg、硫酸盐45-55mg、硝酸铁0.04-0.06mg、复合维生素15-25mg、复合氨基酸1000-1200mg、糖胺聚糖80-90mg和齐墩果酸60-65mg；

所述氯化物为氯化钙、氯化镁、氯化钾和氯化钠；所述氯化钙、氯化镁、氯化钾和氯化钠的质量比为232：28-30：310-312：6995-7000；

所述硫酸盐为硫酸铜、硫酸铁和硫酸镁；所述硫酸铜、硫酸铁和硫酸镁的质量比为0.0013：0.415-0.420：48-49；

复合氨基酸为氨基酸盐酸盐、甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸和缬氨酸；所述氨基酸盐酸盐、甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸和L-缬氨酸的质量比为373-375：18-19：4-5：6-7：7-8：54-55：59-60：17-18：35-36：17-18：26-27：53-54：9-10：52-53；

所述氨基酸盐酸盐为L-精氨酸盐酸盐、L-半胱氨酸盐酸盐、L-胱氨酸二盐酸盐、L-组氨酸盐酸盐、L-赖氨酸盐酸盐和L-酪氨酸二钠盐二水合物；所述L-精氨酸盐酸盐、L-半胱氨酸盐酸盐、L-胱氨酸二盐酸盐、L-组氨酸盐酸盐、L-赖氨酸盐酸盐和L-酪氨酸二钠盐二水合物的质量比为147-148：17-18：31-32：31-32：91-92：55-56；

所述复合维生素为核黄素、d-泛酸钙、叶酸、盐酸硫胺素、肌醇和维生素B₁₂；所述核黄素、d-泛酸钙、叶酸、盐酸硫胺素、肌醇和维生素B₁₂的质量比为0.21-0.22：2.2-2.3：2.6-2.7：2.1-2.2：12-13：0.6-0.7；

所述的培养基用于体外培养细胞的诱导方法，包括如下步骤：

S1：取P3-P4代培养的脐带间充质干细胞或骨髓间充质干细胞，待细胞融合度80%-90%时，换用所述的培养基，培养2-6d，收集培养上清液，过滤，得培养液；

所述培养2-6d的培养条件为：CO₂体积浓度4.5-5.5%、O₂体积浓度1-3%和余下体积浓度的N₂；

S2：将培养液加入至所述的培养基，培养1-2d，进行刺激培养2-3d后，梯度离心，收集外泌体，得外泌体；

所述培养1-2d的培养条件为：CO₂体积浓度4.5-5.5%、O₂体积浓度4-5%和余下体积浓度的N₂；所述刺激培养2-3d的培养条件为：CO₂体积浓度4.5-5.5%和余下体积浓度的N₂；

所述刺激培养为在细胞培养过程中进行重复磁刺激；所述重复磁刺激的条件为：频率12-13 Hz、最大输出强度30-32%、脉冲200-300个/12-16h。

2.根据权利要求1的一种促进体外培养细胞生成外泌体的培养基，其特征在于，每L所述培养基添加糖胺聚糖86mg和齐墩果酸63mg。

3.根据权利要求1的一种促进体外培养细胞生成外泌体的培养基，其特征在于，所述梯度离心为：10000-12000g离心10-15min，取上清液，过滤，100000-110000g离心90-100min。