[发明专利]一种苹果斑点落叶病真菌跨界传递致病的milRNA及其防治方法

说明书

本发明涉及一种苹果斑点落叶病真菌跨界致病的milRNA(Alt‑milR823)及其防治方法。本发明提供所述跨界Alt‑milR823在感病品种接菌后的原位杂交，通过加有5，6‑FAM修饰的锁核酸探针，在接菌后的GL‑3叶片中检测到Alt‑milR823。本发明还提供所述Alt‑milR823的靶基因Md‑PECL4在改良苹果品种的应用，通过将Md‑PECL4过表达在植物表达载体上，导入苹果斑点落叶病感病苹果中，可提高植物的抗病性。由于Md‑PECL4是通过过表达苹果自身基因发挥功能，相比转入外源抗性基因的苹果植株更安全，且更易于被消费者接受。

技术领域

本发明涉及植物分子生物学领域，具体说是一种苹果斑点落叶病真菌跨界传递致病的milRNA及其防治方法。

背景技术

milRNA介导的跨界调控在植物与病原体相互作用中起着重要作用。真菌milRNA已被证明通过调节大丽花轮枝菌、稻瘟病菌和苹果腐烂病中的毒力基因参与植物侵染过程。然而，植物病原真菌的milRNAs介导的跨界调控的功能和机制在很大程度上仍是未知的。苹果斑点落叶病是苹果最主要真菌性病害，侵染苹果叶片后是苹果在生长早期落叶，对苹果的产量产生巨大的影响，因此，探究苹果斑点落叶病的致病机制及防治方法十分必要。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种苹果斑点落叶病真菌跨界传递致病的milRNA及其防治方法。本发明通过比较苹果接种苹果斑点落叶病Alternariasp.mali(ALT1)前后milRNA的表达差异，得到了一种苹果斑点落叶病真菌跨界传递致病的milRNA，命名为Alt-milR823。研究发现与未接种苹果斑点落叶病ALT1、苹果炭疽叶枯病GLS1(Glomerella leaf spot)与苹果褐斑病MLS1(Marssonina leaf spot)的苹果感病品种GL-3相比，接种了ALT1、GLS1与MLSl后的GL-3中Alt-milR823的表达均上升，苹果叶片注射瞬时过表达Alt-milR823载体可增强苹果对ALT1、GLS1与MLS1的易感性。另外，在接种了ALT1、GLS1与MLS1的GL-3的叶片中可以观察到Alt-milR823的存在。进一步通过5‘RACE验证Alt-milR823在10-11位点靶向切割其靶基因Md-PECL4。过表达靶基因后，在GL-3中接种ALT1、GLS1与MLS1后，Alt-mi1R823的表达量下降。因此发明人通过过表达靶基因Md-PECL4开发了抗斑点落叶病的分子手段。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：

一种苹果斑点落叶病真菌跨界传递致病的milRNA(命名为Alt-milR823)，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

一种苹果斑点落叶病真菌跨界传递致病的milRNA的初级转录本(命名为Alt-MILR823)，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

一种检测斑点落叶病感病叶片跨界milRNA的原位杂交方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：取接菌48h后叶片和未接菌叶片，先分别在RNase浸泡15min，然后用pH 7.4的1×PBS洗涤3次；

S2：将经S1处理的叶片样品放置于4％多聚甲醛真空浸润15min，至样品下沉，变成半透明状，然后放到4℃冰箱过夜；

S3：所有样品用1×PBS冲洗3次，每次间隔5min。

S4：经S3处理的样品放置于添加20μg/mL蛋白酶K和0.5％Triton-X的TE缓冲液中37℃处理2-3h，以消化细胞内多余的RNA酶和蛋白质，并渗透细胞以进入探针；

S5：经S4处理的样品在pH 7.4的1x PBS中冲洗3次，每次冲洗间隔5分钟；

S6：在室温下用0.2％甘氨酸浸泡5分钟，以停止蛋白酶活性；