[发明专利]一种基于CRISPR/Cas12a和指数滚环扩增检测miRNA155的方法

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas12a和指数滚环扩增检测miRNA155的方法，属于医学检测领域。本发明通过引入携带有两个酶识别位点的哑铃探针为模板，操作简单，无需退火程序。对miRNA155进行指数滚环扩增(T‑ERCA)，进一步的，T‑ERCA反应的扩增产物ssDNA被CRISPR/Cas12a识别，并激活其反式切割活性，切割外源单链信号探针，释放荧光信号。T‑ERCA和CRISPR/Cas12a的双重扩增效应确保了T‑ERCA/Cas12a检测体系具有较高灵敏度，检测范围从1fM到5nM，检测限为0.31fM。本发明提供的方法操作简单，不需要大型仪器，为CRISPR/Cas传感器平台在临床诊断检测提供新思路和理论基础。

技术领域

本发明涉及一种基于CRISPR/Cas12a和指数滚环扩增检测miRNA155的方法，属于医学检测领域。

背景技术

miRNA是由大约20-25个核苷酸构成，且具有调控功能的小型非编码RNA，通过与靶标mRNA的3'UTR结合进行转录后抑制，参与调节细胞分化、凋亡、增殖和信号转导等生物学过程，发挥其生物学调控功能。已有研究证明了miRNA的异常表达与人类癌症的发生和发展密切相关，其中miRNA155的高表达与乳腺癌的发生有直接的关系，miRNA已被公认为癌症诊断和预后的有效生物标志物。因此，快速、准确地检测miRNAs在疾病诊断和病理分析中至关重要。通常miRNAs具有长度短、易降解、序列相似性和低丰度等固有特性，对其进行高稳定性、高灵敏度和高选择性的定量检测仍然是一个挑战。目前最常用的核酸检测方法是基于聚合酶链式反应(PCR)的信号放大技术，即在PCR体系中加入分子信标，通过分子信标与PCR产物的结合来释放荧光。然而，基于PCR的检测技术高度依赖于昂贵且精密的热循环设备，且需要专门的技术人员操作，限制了PCR技术在低资源配制区域的应用，难以实现现场实时检测和即时诊断。

近几年发展起来的恒温扩增技术是用于miRNA检测最常用于信号放大的方法，无论是在实际操作还是仪器要求方面，都比PCR技术更为简单方便，它摆脱了对热循环设备的依赖，在临床和现场快速诊断中显示了其良好的应用前景。包括滚环扩增(RCA)、催化发夹装配技术(CHA)、杂交链式反应(HCR)、链置换扩增(SDA)和指数扩增。其中，SDA方法涉及较强的非特异性扩增，熵变化驱动的CHA和HCR扩增效率低，RCA和指数扩增的高扩增效率使其成为有效的miRNA检测扩增策略。CRISPR/Cas生物传感器是近几年出现的新型分子诊断技术，其本身就是一种信号放大系统，结合RCA恒温扩增，可构建出级联放大的超灵敏miRNA诊断平台，特别适合低丰度miRNA的检测。此外，CRISPR/Cas对核酸的识别具有序列依赖性，可精确区分单碱基突变靶标，具有高分辨率，确保复杂样本检测的高特异性。

但在现有技术中，在利用滚环扩增RCA反应时，需要利用挂锁探针与待检测目标物以及T4连接酶进行扩增程序，导致非特异性扩增和背景信号的产生，降低检测方法的灵敏度和准确性。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明开发了一种新型等温扩增策略T-ERCA/Cas12a系统，用于miRNA155检测。图1展示了T-ERCA/Cas12a体系的检测过程，包括T-ERCA扩增反应和CRISPR/Cas12a识别两个部分。首先，在靶标(miRNA-155)存在的情况下，T-ERCA反应被触发，由于哑铃探针的扩增模板含有两个切刻内切酶Nt.BbvCI识别位点，在Phi29 DNA聚合酶的辅助下，可实现指数循环扩增，生成大量的ssDNA产物。随后，ssDNA产物可以被Cas12a/crRNA识别，激活Cas12a/crRNA的反式切割活性，并对外源荧光探针进行持续不断的剪切，产生荧光信号，进一步放大信号。因此，基于T-ERCA和CRISPR/Cas12a的双重扩增作用，可以实现对miRNA-155的高灵敏度检测。

本发明提供了一种组合物，所述组合物含有CRISPR/Cas12a蛋白、携带有两个切刻内切酶识别位点的哑铃探针、crRNA、荧光信号探针、DNA聚合酶、切刻内切酶。