[发明专利]一种检测表达非洲猪瘟抗原蛋白的嵌合PRRSV的抗体及其应用

说明书

本发明提供一种有效区分嵌合非洲猪瘟病毒p1217蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒的疫苗株和野生毒株的抗体及其应用，可以区分嵌合疫苗rPRRSV‑p1217、野生型的非洲猪瘟和PRRSV，所述纳米抗体具有较强的抗原特异性，仅与表达非洲猪瘟病毒(ASFV)p1217蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒rPRRSV‑p1217发生抗原抗体反应，与亲本病毒并没有相应的亲和反应。可以有效的区分疫苗株和野生型，便于对疫苗株进行监控，提高疫苗的安全性和可控性。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地说，涉及一种检测表达非洲猪瘟抗原蛋白的嵌合PRRSV的抗体及其应用。

背景技术

ASFV是感染家猪或者野猪引起的一种急性、烈性、出血性，高度接触性传染病。其特征是病程短、高热和出血性病变，急性感染死亡率高达100％。严重威胁全球养猪业。目前尚没有有效的疫苗和治疗方法。ASF疫情使我国生猪存栏量和出栏量下降20％-50％，许多猪场因ASF疫情完全覆没，严重削弱了我国猪肉的有效供给，导致我国生猪和猪肉价格均出现翻番。ASF的病原ASFV是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，为大型双链DNA病毒，主要在巨噬细胞中复制，其基因组约170-193kb，含有150-167个ORF，编码150-200种蛋白质。ASFV粒子直径约为200nm，呈20面体结构，由多层同心圆结构组成，由内到外依次是类核(Nucleoid)、核壳(Core shell)、内囊膜(Inner envelope)、衣壳(Capsid)和外囊膜(External envelope)。

ASFV的p12蛋白是ASFV感染晚期表达的膜蛋白，由O61R基因编码，共186nt，其分子量大小约为6.7kD。其C-末端区域富含半胱氨酸的结构域，参与病毒的吸附。有学者通过免疫电子显微镜发现，该蛋白位于病毒粒子层，细胞表面的膜蛋白是ASFV的受体。在病毒侵染细胞时，可吸附细胞膜，使病毒进入细胞内。在机体外，p12蛋白的抗体可阻断ASFV侵入宿主细胞。另外，利用HEK293细胞表达p12蛋白，纯化后免疫猪能产生针对p12的特异性抗体，表明p12具有一定的免疫原性。另一方面，ASFV的P17蛋白是ASFV表达的晚期膜蛋白，由D117L基因编码，核苷酸序列共354nt，编码蛋白大小为13.1kD。位于病毒内膜的跨膜蛋白。与早期膜蛋白p1217一样，p17对于病毒活力至关重要，能促进ASFV病毒的二十面体颗粒形成。若缺失p17，组装后的病毒将变得不稳定，失去感染作用。p17蛋白还同时具有抑制蛋白水解的作用，使多聚蛋白pp220和pp62不能进一步水解。

本实验室前期研究成果证实了在高致病性PRRSV弱毒疫苗株HuN4-F112的全长感染性克隆骨架上，插入ASFV的p12蛋白和p17蛋白，获得能够稳定表达ASFV p12和p17融合蛋白的重组PRRS病毒。已经成功开发出一种表达非洲猪瘟病毒(ASFV)p12和p17蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组质粒pA-ASFV-p1217，使用重组质粒pA-ASFV-p1217，转染MARC-145细胞后所拯救出来的病毒具有和亲本病毒vHuN4-F112相似的病毒生物学特性。并且在至少连续20代次的细胞传代过程中能够保持遗传稳定性。同时，基于上述重组质粒，转染MARC-145细胞后拯救出的一株重组PRRS病毒：rPRRSV-p1217。能与p12或p17的鼠源多抗以及PRRSV的N蛋白的单抗发生抗原抗体反应，出现特异性的免疫荧光。说明该重组病毒rPRRSV-p1217能够稳定高效的表达ASFV的p12和p17蛋白是一种新型的基因工程活载体疫苗用于非洲猪瘟的免疫保护。