[发明专利]一种鉴定PGPR趋化根系分泌物到达根际的趋化速率的方法及其应用

权利要求书

1.一种鉴定PGPR趋化根系分泌物到达根际的趋化速率的方法，其特征在于，步骤为：

（1）从微生物基因组的注释中查找该微生物的胞外配体结合域，筛选能够识别胞外趋化物的趋化受体，利用分子对接技术将趋化受体与根系分泌物成分进行分子对接，并计算结合自由能，筛选自由能值低的根系分泌物成分作为候选趋化物；

（2）根据候选趋化物确定与候选趋化物对应的受体蛋白，以微生物的基因组DNA为模板，构建含有受体蛋白的胞外配体结合域片段的表达载体和敲除受体蛋白的重组载体；所述步骤（2）中根据候选趋化物确定与候选趋化物对应的受体蛋白是先利用毛细管趋化方法测定微生物趋化阈浓度值，确定该微生物对趋化物的响应强度，再采用荧光热漂移法和平板趋化法进一步鉴定该候选强趋化物的受体蛋白；

（3）将含有步骤（2）的重组载体的大肠杆菌通过接合方法转入微生物中获得趋化受体敲除突变株；

（4）以微生物的基因组DNA为模板，构建步骤（2）中候选趋化物对应的受体蛋白的回补质粒和回补空载质粒，分别转入步骤（3）的趋化受体敲除突变株中，获得趋化受体敲除突变株的回补株和回补空载株；

（5）将微生物、趋化受体敲除突变株、趋化受体敲除突变株的回补株和回补空载株与候选趋化物先进行平板趋化实验验证受体蛋白与趋化物的对应性，再利用微环境系统测定微生物、趋化受体敲除突变株和趋化受体敲除突变株的回补株在小麦根际的趋化速率和增殖速率。

2.根据权利要求1所述的鉴定PGPR趋化不同趋化物到达根际速率的方法，其特征在于：所述步骤（1）中根系分泌物成分包括氨基酸类、有机酸类和糖类；分子对接通过分子对接软件AutoDock 4.2实现；结合自由能是通过软件Amber17 计算的。

3.根据权利要求2所述的鉴定PGPR趋化不同趋化物到达根际速率的方法，其特征在于：采用荧光热漂移法筛选趋化物与受体蛋白的荧光热漂移值高于2.0℃。

4.根据权利要求3所述的鉴定PGPR趋化不同趋化物到达根际速率的方法，其特征在于：所述步骤（3）中大肠杆菌为大肠杆菌S17-1。

5.根据权利要求4所述的鉴定PGPR趋化不同趋化物到达根际速率的方法，其特征在于，所述步骤（5）中利用微环境系统的具体操作为：

a. 向带盖试管中加入接种菌悬液的0.5×MS培养液，并将无菌小麦苗的根茎结合部用滤网固定在液面处；

b. 将步骤a处理后的小麦苗样品置于16h光照8h黑暗培养，其中一半小麦苗接菌培养2h后取出转移至未接种菌悬液的微环境系统中培养，作为转移组，另一半为未转移组；

c. 步骤b中的两组麦苗分别在2 h、6 h、10 h、14 h、18 h、22 h、26 h、30 h、34 h和38h时取样，测定根际定殖的细菌数量；

d. 采用Logistic方程拟合细菌在根际的生长动力学方程，并求其一阶导数得到生长速率值，通过计算获得不同接种菌的小麦根际趋化速率和增殖速率。

6.根据权利要求5所述的鉴定PGPR趋化不同趋化物到达根际速率的方法，其特征在于：所述步骤a中接种菌指微生物、趋化受体敲除突变株和趋化受体敲除突变株的回补株。

7.根据权利要求6所述的鉴定PGPR趋化不同趋化物到达根际速率的方法，其特征在于：所述步骤b中小麦苗样品置于16h光照8h黑暗培养时小麦苗的根部需要遮光处理。

8.根据权利要求6所述的鉴定PGPR趋化不同趋化物到达根际速率的方法，其特征在于：所述步骤d中小麦根际增殖速率为转移组生长速率，小麦根际趋化速率为未转移组生长速率与转移组生长速率的差值。

9.权利要求1-8任一项所述的方法在鉴定趋化物是PGPR在根际趋化定殖的强趋化物中的应用，其特征在于：如果趋化受体敲除突变株趋化速率显著低于微生物和趋化受体敲除突变株的回补株，即可确定该趋化物是PGPR在根际趋化定殖的强趋化物。