[发明专利]Ⅰ型猫冠状病毒病毒样颗粒、制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种Ⅰ型猫冠状病毒病毒样颗粒、制备方法及应用，所述Ⅰ型猫冠状病毒病毒样颗粒由能够稳定分泌猫冠状病毒E、M、N和S蛋白的四种重组杆状病毒共感染后组装生成，包含完整的猫冠状病毒E、M、N和S蛋白，大小约70～120nm，形态与天然病毒一致。将本发明得到的Ⅰ型猫冠状病毒病毒样颗粒免疫小鼠后能够均能够产生高滴度的抗体水平，同时刺激机体产生细胞免疫。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及Ⅰ型猫冠状病毒病毒样颗粒、制备方法及应用。

背景技术

猫冠状病毒(Feline coronavirus, FCoV)属于冠状病毒科，α冠状病毒属，编码四种结构蛋白：纤突糖蛋白（S）、膜蛋白（M）、包膜蛋白（E）和核衣壳蛋白（N）。冠状病毒的S蛋白是一种膜糖蛋白，被认为是结合和进入细胞的病毒调节因子，是诱导中和抗体产生的主要抗原。M蛋白是最丰富的包膜蛋白，可驱动其他结构组装入VLP中。E蛋白与M蛋白均可促进病毒粒子组装和释放。N蛋白是病毒核衣壳中唯一已知的蛋白组成部分。FCoV首先会入侵小肠绒毛上皮细胞并在细胞内复制，感染后2-3天FCoV会通过粪便进行散毒，这种感染通常是无症状的，但有时会伴有肠炎表现。感染后2周，可在结肠内发现病毒，而回盲交界处是持续性感染无症状病毒携带猫的主要病毒复制部位。

FCoV根据S蛋白氨基酸序列差异分为2种基因型：I型和II型。基因I型FCoV是主要流行基因型，在世界范围内广泛流行，感染率高达80-95%；基因II型FCoV由犬冠状病毒(Canine coronavirus，CCoV)和基因І型FCoV同源重组而来，在临床中不常见，主要流行与亚洲地区。根据导致的临床症状和病理变化FCoV又可分为猫肠道冠状病毒（Felineenteric coronavirus，FECV）和猫传染性腹膜炎病毒（Feline infectious peritonitisvirus，FIPV）两种生物型。目前普遍认为，FIPV是由FECV在猫体内发生突变而来。FIPV导致的猫传染性腹膜炎（Feline infectious peritonitis，FIP）是一种慢性致死性疾病，主要特征为腹腔积液或者胸腔积液，剖检可见腹腔含有纤维蛋白的淡黄色积液，在肝脏、肾脏和网膜表面存在白色颗粒状的炎性渗出物，覆盖肝脏或脾脏并延伸到实质中，是各年龄阶段的猫死亡的主要原因之一。FECV的感染则仅局限于消化道，会引起猫的体温上升，食欲不振甚至脱水等症状。基因I型和II型FCoV均可在体内突变为FIPV。

在冠状病毒家族中，严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(Severe AcuteRespiratory Syndrome Coronavirus 2, SARS-CoV-2)、猪流行性腹泻病毒（PorcineEpizootic Diarrhea Virus，PEDV）和牛冠状病毒(Bovine CoV, BCoV)等的病毒样颗粒(Virus-like particles, VLPs)均已在实验室构建成功。VLPs由于其缺乏病毒遗传物质并且空间构象类似于真实病毒，具有良好的安全性和免疫原性，近年来已成为疫苗研究领域的热点。杆状病毒-昆虫细胞系统蛋白表达产量高，并且显示完整的包括糖基化在内的翻译后修饰，是目前表达生产VLPs应用最为广泛的系统。到目前为止，几种基于VLPs的疫苗已经商品化生产，例如重组乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）疫苗、人乳头瘤病毒（HumanPapillomavirus，HPV）疫苗、人戊肝病毒（Hepatitis E Virus，HEV）疫苗和猪圆环病毒2型（Porcine circovirus-2, PCV-2）疫苗等，但FCoV的VLPs仍未见报道。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供Ⅰ型猫冠状病毒病毒样颗粒、制备方法及应用。

第一方面，本发明提供一种Ⅰ型猫冠状病毒结构蛋白基因，包括以下蛋白中的至少一种：包膜蛋白E基因、膜蛋白M基因、核衣壳蛋白N基因和纤突糖蛋白S基因，并进行扩增；

所述包膜蛋白E基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；