[发明专利]肺类器官培养方法及培养基

权利要求书

1.一种基础肺类器官培养基，其特征在于，包括组分：Advanced DMEM/F12、GlutaMax、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、青霉素/链霉素双抗、B-27Supplement、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、P38MAPK抑制剂、ALK5抑制剂、成纤维生长因子-7、重组小鼠头蛋白、重组人Rspo1蛋白、成纤维生长因-10、ROCK抑制剂；优选地，所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸的终浓度为10mM；优选地，所述N-乙酰半胱氨酸的终浓度为1-1.5mM；优选地，所述烟酰胺的终浓度为5-7mM；优选地，所述P38 MAPK抑制剂的终浓度为500-700nM；优选地，所述ALK5抑制剂的终浓度为500-600nM；优选地，所述成纤维生长因子-7的终浓度为25-30ng/mL；优选地，所述重组小鼠头蛋白的终浓度为100-120ng/mL；优选地，所述重组人Rspo1蛋白的终浓度为500-700ng/mL；优选地，所述成纤维生长因-10的终浓度为100-150ng/mL；优选地，所述ROCK抑制剂的终浓度为4-8μM。

2.一种肺泡类器官培养基，其特征在于，包括组分：Advanced DMEM/F12、GlutaMax、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、青霉素/链霉素双抗、B-27Supplement、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、P38MAPK抑制剂、ALK5抑制剂、成纤维生长因子-7、重组小鼠头蛋白、重组人Rspo1蛋白、成纤维生长因-10、ROCK抑制剂；优选地，所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸的终浓度为10mM；优选地，所述N-乙酰半胱氨酸的终浓度为1.25mM；优选地，所述烟酰胺的终浓度为5mM；优选地，所述P38MAPK抑制剂的终浓度为500-700nM；优选地，所述ALK5抑制剂的终浓度为500-600nM；优选地，所述成纤维生长因子-7的终浓度为16-20ng/mL；优选地，所述重组小鼠头蛋白的终浓度为40-55ng/mL；优选地，所述重组人Rspo1蛋白的终浓度为180-200ng/mL；优选地，所述成纤维生长因-10的终浓度为40-60ng/mL；优选地，所述ROCK抑制剂的终浓度为5-8μM。

3.一种ASC来源肺类器官的培养方法，其特征在于，包括步骤：

1)成体干细胞在权利要求1所述基础肺类器官培养基中培养，每15天进行传代一次，共进行二次传代，得到中间组织；

2)利用权利要求2所述肺泡类器官培养基对所述中间组织进行培养，每30天传代一次。

4.根据权利要求3所述培养方法，其特征在于，所述步骤1)中所述成体干细胞是利用胶原酶将获得的肺组织消化为细胞团，并利用基质胶重悬，添加所述基础肺类器官培养基培养，每3天更换一次所述基础肺类器官培养基。

5.根据权利要求4所述培养方法，其特征在于，每次更换培养基前先对新鲜的所述基础肺类器官培养基进行预热至37.0±0.5℃。

6.根据权利要求3所述培养方法，其特征在于，所述步骤2)中，当第一次传代前未出现肺泡结构，则利用重组胰蛋白酶类似物消化所述中间组织后进行传代。

7.根据权利要求3或6所述培养方法，其特征在于，所述步骤2)具体包括以下步骤：

2-1)去除所述基础肺类器官培养基，向所述中间组织加入细胞收集缓冲液；

2-2)加入基质胶重悬，在4℃摇床振荡孵育，后加入HBSS，在4℃下离心，去除上清液；

2-3)沉淀物使用机械破碎的方式解离，后加入HBSS，在4℃下离心，去除上清液；

2-4)向沉淀物加入基质胶，重悬后再加入所述肺泡类器官培养基；

2-5)每3.5天更换所述肺泡类器官培养基。

8.根据权利要求7所述培养方法，其特征在于，所述离心处理的参数设置为400xg离心5min。

9.根据权利要求7所述培养方法，其特征在于，所述HBSS中含有1％的FBS。

10.根据权利要求7所述培养方法，其特征在于，所述步骤2-2)去除上清液后，加入重组胰蛋白酶类似物，37℃孵育。