[发明专利]检测人类Y染色体微缺失的重组酶介导等温扩增引物探针组及方法

说明书

本发明公开了检测人类Y染色体微缺失的重组酶介导等温扩增引物探针组及方法，包括检测与男性不育相关Y染色体中的微缺失，属于生物检测技术领域。本发明提供重组酶介导等温扩增检测Y染色体微缺失的引物探针组，能够检测Y染色体AZFa区域sY84和sY86位点、AZFb区域sY127和sY134位点、AZFc区域sY254和sY255位点的微缺失，同时提供检测一个内参基因(SRY)的引物与探针。本发明检测时间短，能够在30分钟内完成对待检者基因组DNA样品Y染色体微缺失准确灵敏的检测。

技术领域

本发明属于体外核酸分子检测领域，具体为一种采用重组酶介导的等温扩增技术快速检测人类Y染色体微缺失的引物探针组及检测方法。

背景技术

不孕不育被认为是一个复杂的生殖健康问题，目前约有10-15％的夫妇受到影响。社会的发展改变了人类的生活方式，逐渐导致环境中污染物的增加。此外，不良的饮食习惯、一些药品和化学品的使用、日常有害辐射的暴露、生活和工作中的生理及心理压力、吸烟与久坐的不良习惯、肥胖和遗传因素等都能影响人类的生育。男性因素在不孕不育症中占40-50％，主要是男性生精障碍，表现为严重少精或无精子，其中遗传因素是主要原因之一。

据世界卫生组织(WHO)统计，30％以上的男性不育症患者是由于基因缺陷导致精子生成障碍所引起的，在临床上主要表现为严重少精子症和无精子症。约10-15％的无精症患者和5-10％的严重少精症患者至少有一种Y染色体微缺失。

Y染色体长臂(Yq)微缺失是男性不育症最常见的遗传因素，是继克氏综合征后的第二大遗传因素。Y染色体长臂上存在着与精子发生相关的基因，称为无精子症因子(azoospemia factor，AZF)，AZF中任何一个区域的微缺失都足以导致精子生成的障碍。

AZFa区部分缺失与精子的生成过程有关，AZFa区完全缺失会完全阻断生精小管内生殖细胞的生成与成熟，此种缺失的患者，当进行睾丸活检时发现仅有支持细胞而无生殖细胞如精原细胞。因此，借助辅助生殖技术寻求成熟精子是几乎不可能的。AZFb区缺乏症通常表现为精子不成熟。AZFc缺失的临床表现最为广泛，它的范围可以从正常精子到中度或严重少精子，甚至无精子。AZFc区缺失阳性的患者，如表现为无精子症或严重的少精子症，其自然受孕的概率非常低，可使用辅助生殖技术从睾丸组织寻找精子和通过胞质内精子注射技术人工受精，避免不必要的外科和医疗护理。可见，这类患者可经人工授精将AZFc微缺失遗传给男性后代。

2015年我国男性生殖遗传学检查专家达成共识，建议对非梗阻性无精子症以及严重的少精子症患者进行Y染色体微缺失检测，可以为男性不育患者找出病因，为遗传咨询提供依据，也为临床医生的后续治疗提供指导。Y染色体微缺失检测主要通过检测Y染色体上特异性序列标签位点(Sequence T agged Sites,STS)位点是否存在缺失，进一步推断Y染色体是否存在微缺失以及具体的缺失类型。目前，最常用的检测方案均以2014年欧洲男科学会/欧洲分子遗传实验质控网(EAA/EMQN)联合发表的Y染色体微缺失检测指南为依据，即必须检测6个基础性Y染色体特异性序列标签STS位点(s Y84、sY86、sY127、sY134、sY245、sY255)，判断受检者是否存在AZF微缺失。

目前，Y染色体微缺失的常用检测方法包括实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)和多重PCR-电泳法等。实时荧光定量PCR法多为单通道或者两通道检测，检测Y染色体微缺失需要对多个位点进行检测，检测通量较低，不仅增加了工作量和分析难度，也增加了由于样本混淆或其它原因导致的交叉污染几率。多重PCR-电泳法，通过琼脂糖电泳检测的方法来确定Y染色体相应区域是否存在缺失，检测成本低，但是操作繁琐，不易实现高通量检测。

近年来，重组酶介导的等温扩增技术具有无需热变性、引物设计简单、在37-42℃恒温条件下可快速完成核酸扩增、特异性好、不需复杂仪器设备等特点，已广泛应用于医学检测，包括病原微生物和基因突变的检测。

发明内容