[发明专利]NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变转基因小鼠及其构建方法和应用

权利要求书

1.NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变转基因小鼠的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，构建带有LoxP序列并定点敲入NOTCH2NLC基因的小鼠：在小鼠体内的Rosa26基因位点，定点插入CAG-Loxp-Stop-Loxp-NOTCH2NLC-(GGC)n-3tag-WPRE-polyA表达框，繁育并鉴定出F0代阳性小鼠；所述n为自然数，且n≥60；

S2，将F0代阳性小鼠与野生型小鼠交配并繁殖，获得F1代小鼠，鉴定出阳性F1代杂合子条件性转基因小鼠；

S3，将阳性F1代杂合子条件性转基因小鼠与野生型小鼠回交m代，其中，m为自然数，且m≥2，得到F_(1+m)代杂合子条件性转基因小鼠；将F_(1+m)代杂合子条件性转基因小鼠之间交配并繁殖，得到纯合子条件性转基因小鼠；

S4，将F_(1+m)代杂合子条件性转基因小鼠或纯合子条件性转基因小鼠与cre工具小鼠杂交，获得转基因小鼠。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S1中，所述n为98。

3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S1中，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术定点插入所述表达框。

4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤S1中，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术定点插入所述表达框的具体方法为：

1)、针对Rosa26位点设计gRNA靶序列，所述gRNA的基因序列为：GGGGACACACTAAGGGAGCTTGG；

2)、将外源NOTCH2NLC-(GGC)n-3tag通过AgeI和EcorV酶切，连接至donor质粒上，获得CAG-Loxp-Stop-Loxp-NOTCH2NLC-(GGC)n-3tag-WPRE-polyA重组donor质粒；

3)、将Cas9 mRNA、gRNA及重组donor质粒进行小鼠受精卵注射，然后将注射后的小鼠受精卵移植到假孕母鼠中，孕育的小鼠为F0代小鼠。

5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，将获得的重组donor质粒转化入STBL3大肠杆菌感受态细胞中进行扩增，扩增时，在25-30℃培养46-50小时。

6.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S1中，通过长片段PCR扩增和电泳的方法鉴定出F0代阳性小鼠；

所述长片段PCR扩增时的引物为：

长片段PCR 5′同源臂鉴定引物信息：

正向引物I：5′-GCCGGGCCTCGTCGTCTG-3′

反向引物II：5′-TGAGGGCAATCTGGGAAGGTT-3′；

长片段PCR 3′同源臂鉴定引物信息：

正向引物III：5′-GGGGGAGGGGAGTGTTGC-3′

反向引物IV：5′-TTCTTCCTGCCTGCCTTCTGTGAC-3′；

电泳后，5端臂产生泳道条带大小为3.4kb和5.1kb，且3端臂产生泳道条带大小为6.5kb和3.6kb时，对应的待测小鼠即为F0代阳性小鼠。

7.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S2中，通过PCR扩增和测序的方法，或通过PCR扩增和电泳的方法鉴定出阳性F1代杂合子条件性转基因小鼠；

所述PCR扩增时的引物为：

鉴定引物I：TAAAGGCCACTCAATGCTCACTAA

鉴定引物II：TCAGATTCTTTTATAGGGGACACA；

鉴定引物III:GCGCAGGATCCTACCCATAC

鉴定引物IV:AAAGTCCCGGAAAGGAGCTG；

电泳后，同时产生967bp和604bp的泳道条带时，对应的待测小鼠即为阳性F1代杂合子条件性转基因小鼠。