[发明专利]羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶、编码基因、工程菌及应用

说明书

本发明公开了一种羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶、编码基因、工程菌及应用，本发明实现了羰基还原酶(SRED)和葡萄糖脱氢酶(GDH)的融合表达，节约了发酵成本，降低了发酵废液的产生量，对环境友好。融合表达不影响羰基还原酶的光学选择性，大幅降低了反应中所使用的辅酶因子，节约了反应成本。该羰基还原酶有广泛的底物谱和良好的立体选择性，用本发明方法制备所得的含羰基还原酶SRED和葡萄糖脱氢酶GDH的重组酶具有对环境友好、操作简单、反应条件温和等优点，具有良好的工业应用前景。

(一)技术领域

本发明涉及一种羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶、编码基因、工程菌及应用。

(二)背景技术

(S)-1-(3-(三氟甲基)苯基)乙醇，CAS号96789-80-9，密度1.234g/cm³，分子量190.162，易溶于有机溶剂如乙酸乙酯，微溶于水，具有特殊的生物活性，是合成手性药物(S)-MA20565的重要手性中间体。(S)-MA20565最先由三菱化学集团报道，因其带有N-甲基甲氧基亚氨基乙酰胺作为药效团和取代的醛肟醚侧链，显示出对多种病害菌的有效杀菌活性，为广谱农业杀菌剂。(S)-MA20565重要商用应用价值促使我们对其手性中间体(S)-1-(3-(三氟甲基)苯基)乙醇进行研究。

目前，(S)-1-(3-(三氟甲基)苯基)乙醇的合成多以化学方式为主，以潜手性酮为原料，使用昂贵的稀有金属钌络合物为催化剂制备。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶、编码基因、工程菌及应用，通过连接肽使羰基还原酶(SRED)与葡萄糖脱氢酶(GDH)融合表达，作为生物催化剂用于不对称还原手性酮制备手性醇，在不影响羰基还原酶的高催化活性和高光学选择性的基础上，降低了反应所需成本，解决了反应中辅酶消耗问题，建立了一条反应条件温和、绿色环保、光学选择性高的生物合成路线，提高了原子经济性。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶，所述融合酶氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明所述融合酶是将羰基还原酶SRED和葡萄糖脱氢酶GDH通过连接肽融合而成，所述羰基还原酶氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

所述融合酶按如下方法构建：将来源于近平滑假丝酵母菌(Candidaparapsilosis)ATCC 7330的基因组经PCR扩增获得带有连接肽的羰基还原酶SRED编码基因片段；再将来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的葡萄糖脱氢酶GDH的基因经PCR扩增获得带有连接肽的葡萄糖脱氢酶GDH编码基因片段；以无缝克隆技术融合连接带有连接肽的羰基还原酶SRED编码基因片段和带有连接肽的葡萄糖脱氢酶GDH编码基因片段至线性化载体pET-Duet1，导入E.coli DH5α感受态细胞中，挑选单菌落测序验证成功后将质粒导入表达宿主细胞E.coli BL21(DE3)构建重组菌，诱导重组菌产酶，经超声破碎处理后，离心后弃去沉淀得到粗酶液，经镍柱纯化得到融合酶纯酶。

本发明还提供一种所述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶的编码基因，所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还涉及含所述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶的编码基因的重组载体，由重组载体构建获得的重组菌；所述重组载体以pET-Duet1为基础载体，所述重组菌以E.coli BL21(DE3)为宿主菌。