[发明专利]一种HEL-S-283基因敲除人结肠癌HCT116细胞株的构建方法

权利要求书

1.一种HEL-S-283基因敲除人结肠癌HCT116细胞株的构建备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)针对人结肠癌HCT116细胞HEL-S-283基因的编码序列，设计得到sgRNAs序列，包含sgRNA1和sgRNA2；

(2)将步骤(1)得到的sgRNAs克隆到CRISPR-V2载体上，获得CRISPR-V2-HEL-S-283-gRNA1和CRISPR-V2-HEL-S-283-gRNA2质粒；

(3)使用脂质体转染法，将所述步骤(2)中的CRISPR-V2-HEL-S-283-gRNA1和CRISPR-V2-HEL-S-283-gRNA2质粒共转入人结肠癌HCT116细胞株；

(4)将转染后的HCT116细胞株常规培养36-48小时；

(5)第一次筛选：对步骤(4)中培养后的细胞有限稀释法获得单克隆细胞，培养得到单克隆细胞株；

(6)第二次筛选：对步骤(5)中获得的单克隆细胞株有限稀释法获得单克隆细胞，继续培养得到HCT116 HEL-S-283^-/-单克隆细胞株；

(7)提取HCT116 HEL-S-283^-/-单克隆细胞株基因组DNA，PCR扩增sgRNA序列，分析扩增产物；无法扩增出理论长度片段的细胞株，即为HCT116 HEL-S-283^-/-细胞株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述sgRNAs的靶序列分别为：TCATGGTAGGATTGTGACAAAGG和AACCATGAAGTCATCTAGCAGGG。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤(3)中，所述转染中用到的转染试剂为Lipofectamine^TM3000；

和/或，步骤(5)和步骤(6)中所述的有限稀释法中的铺板细胞密度为0.3～0.5个细胞/孔；

和/或，步骤(5)中，所述的培养的时间为7～14天；

和/或，步骤(6)中，所述的培养时间为7天。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(7)中，所述PCR扩增引物序列为：

Primers for Region 1上游引物:GGGTATCTTGTGATGGAGATGTGG

Primers for Region 1下游引物:GCACTTCAGGTGGGGTACTT；

Primers for Region 2上游引物:TCCTCCTCTTCTCTCTCTTTCCA

Primers for Region 2下游引物:TGAGATGGAGTTTCGCTCTTGT；

Primers for Region 3上游引物:GGGTATCTTGTGATGGAGATGTGG

Primers for Region 3下游引物:TGAGATGGAGTTTCGCTCTTGT。

5.根据权利要求1-4之任一项所述的方法构建得到的HEL-S-283基因敲除人结肠癌HCT116细胞株。

6.sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的靶序列如下：TCATGGTAGGATTGTGACAAAGG和AACCATGAAGTCATCTAGCAGGG。

7.根据权利要求6所述的sgRNA在构建HEL-S-283基因敲除人结肠癌HCT116细胞株中的应用。