[发明专利]一种多焦点扫描与阵列式多通道探测成像方法、设备及介质

说明书

本发明涉及一种多焦点扫描与阵列式多通道探测成像方法、设备及介质，涉及激光扫描及荧光探测成像技术领域。该方法包括步骤：多个激光焦点各自进行扫描形成激光扫描区域；建立激光扫描区域与多个探测通道形成的探测区域之间的对应关系；在每个时间点，根据每个激光焦点的扫描位置，在对应的探测区域内仅选通对应像斑当前所在位置的探测通道；控制每个激光焦点的扫描相位来保持相邻的激光焦点之间的扫描间隔距离；当激光焦点的扫描位置离开选通的探测通道时，关闭该探测通道，并仅选通激光焦点进入的扫描区域对应的探测区域内的探测通道。本发明在提高成像通量的同时能有效避免荧光串扰的产生，同时不影响双光子成像深度、成像区域连续性。

技术领域

本发明涉及激光扫描及荧光探测成像技术领域，特别涉及一种多焦点扫描与阵列式多通道探测成像方法、设备及介质。

背景技术

由于双光子显微成像技术能在厚生物组织内保持优良的成像分辨率，目前在脑科学研究、肿瘤病理等领域使用越来越广泛。

双光子显微镜与共聚焦显微镜类似，都属于激光扫描荧光显微镜，使用激光束在物镜焦面处形成激光焦点，一般采用逐点扫描方式对样品进行二维或三维的扫描，激发各点处的荧光分子，通过在像方使用探测器探测荧光信号的强弱，进而形成基于荧光强度的图像，从而反映样品的结构和功能信息。

逐点扫描方式一定程度限制了双光子成像速度的提高，因此近年来人们越来越多地采用多个激光焦点同时扫描的方式来提高双光子成像通量。

多焦点扫描激发形成了多个荧光源，需要在探测端(或像方)对荧光源进行区分，否则荧光源之间的荧光串扰会影响图像信息的准确性，以及出现图像伪影等问题。

多焦点扫描成像的一种探测方式是采用相机(CCD或CMOS)替代常规的光电倍增管(PMT)作为探测器件。相机的阵元很多很密(通常百万级～千万级像素)，具备与物方视场的空间对应性，即相机(像方)的每个像素与物方视野的某一个点是对应的，因此能区分开荧光所属焦点来源。如期刊文献”Ki l ohertz two-photon bra i n imag i ng i n awakemi ce”,Tong Zhang et a l,Nature Methods,2019，使用微透镜阵列形成20×20激光焦点，使用sCMOS相机进行探测，获得了1kHz成像帧率。但是随着成像深度增加，焦点激发出的荧光经过上层组织散射后，到达像方相机探测面时已经被散射成弥散像斑，半径比理想的衍射像斑要大得多。而相机探测虽然具有空间对应性，但时间分辨能力不足，同次曝光时间内的空间结构信息将与弥散斑进行卷积，最终降低了成像空间分辨率。因此使用相机探测方案的多焦点双光子成像方法，成像深度会有所限制。

多焦点扫描成像的另一种探测方式是采用多通道或多阵元光电探测器，如多阳极PMT或多只PMT组装而成的探测模块。光电探测器，如PMT，时间分辨能力高，能结合激光焦点扫描时序反推出扫描位置，因此空间分辨率不受弥散像斑半径影响，光学分辨率一般仅取决于激光焦点的聚焦程度。目前，这种多通道光电探测器方式，每个激光焦点的扫描区域对应一个探测通道或探测阵元的面积，即激光焦点数与探测通道或阵元数量是相等的。当激光焦点位于两个扫描区域的边界处时，由于弥散像斑半径较大，荧光光子很容易跨越到相邻探测阵元的面积内，造成荧光源之间的荧光串扰。

为了避免这种串扰，一种策略是使探测阵元之间存在足够缝隙，但造成了成像区域间的不连续性。另一种策略是使不同激光焦点的激光脉冲存在一定延时，如双光子显微镜常用的80MHz重复频率飞秒激光器，脉冲周期是12.5ns，可以进行四分时，即4个激光焦点的脉冲时间依次相差3.125ns，这样产生的荧光信号也存在相同延时，因此能从时间上进一步分离荧光来源避免串扰。如申请号为CN202110897601.7的中国专利提出了脉冲4分时进一步结合“四色边界原理”，进一步拓宽了脉冲延时法所允许焦点数量，由通常的4个焦点拓宽到理论上的无数个。