[发明专利]一种革兰氏阴性菌的药敏鉴定方法

权利要求书

1.一种革兰氏阴性菌的药敏鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：抗生素、氘水孵育细菌：向抗生素溶液中接种革兰氏阴性菌，配制成浓度为10³-5×10³CFU/ml的悬浮菌液，再于96孔板的各孔中加入20ul的该悬浮菌液和20ul氘水，37℃恒温孵育30min；

S2：药敏样品自动化层流洗涤：将含S1孵育后悬浮菌液的96孔板置于层流洗涤系统中，依次以1wt％Tween 20/70wt％乙醇混合液、1wt％Tween 20溶液、洗涤缓冲液进行灌注，并设置流速为5-10μl/s、洗涤循环次数为5-10次，利用重力和流体力学的层流效应进行自动化洗涤，洗涤时间为2-4min；

S3：拉曼光谱检测：吸取S2层流洗涤所得悬浮菌液5ul，滴于玻片上，晾干后，进行拉曼光谱检测；

S4：药敏性结果分析：根据S3所得拉曼光谱图，观察拉曼位移在2200波数处是否出现氘水拉曼峰，以鉴定革兰氏阴性菌对抗生素是否敏感。

2.根据权利要求1所述的一种革兰氏阴性菌的药敏鉴定方法，其特征在于，所述抗生素溶液中抗生素的浓度范围介于0.1-50μg/mL。

3.根据权利要求2所述的一种革兰氏阴性菌的药敏鉴定方法，其特征在于，所述抗生素包括青霉素G、氨苄西林、羧苄西林、庆大霉素、妥布霉素、乙酰螺旋霉素、罗红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、多西环素、米诺环素、四环素、万古霉素、多粘菌素中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的一种革兰氏阴性菌的药敏鉴定方法，其特征在于，所述革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、产气肠杆菌、布氏杆菌、不动杆菌、百日咳杆菌、霍乱弧菌、副溶血性杆菌中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的一种革兰氏阴性菌的药敏鉴定方法，其特征在于，所述96孔板与层流洗涤系统相配套。

6.根据权利要求1或5所述的一种革兰氏阴性菌的药敏鉴定方法，其特征在于，所述洗涤缓冲液由Tween 20与0.01M、pH为7.2的PBS缓冲液按1：99的质量比混合而成。

7.根据权利要求1所述的一种革兰氏阴性菌的药敏鉴定方法，其特征在于，所述拉曼光谱检测参数：激光波长为532mm，激光功率为50mw，光栅常数为600gr/mm，积分时间为3s，积分次数为1次。

8.根据权利要求1所述的一种革兰氏阴性菌的药敏鉴定方法，其特征在于，S4中，鉴定革兰氏阴性菌对抗生素是否敏感的具体方法为：

若拉曼位移在2200波数处无氘水拉曼峰，表明革兰氏阴性菌未吸入氘水，对抗生素无明显代谢作用，则抗生素有效，革兰氏阴性菌对抗生素敏感；

若拉曼位移在2200波数处有显著氘水拉曼峰，表明革兰氏阴性菌吸入氘水，对抗生素存在代谢作用，则抗生素无效，革兰氏阴性菌对抗生素不敏感。