[发明专利]威尼斯镰刀菌TB01的整合位点及其应用

权利要求书

1.威尼斯镰刀菌TB01的整合位点，其特征在于，包括两个配套CRISPR/Cas9系统使用的整合位点，其分别位于：威尼斯镰刀菌TB01的1号染色体FVRRES_00686基因上游5438bp处和威尼斯镰刀菌TB01的1号染色体FVRRES_00686基因上游4499bp处。

2.根据权利要求1所述的威尼斯镰刀菌TB01的整合位点，其特征在于，GFP表达盒在所述威尼斯镰刀菌TB01上的插入位点为1号染色体FVRRES_00686基因上游4886bp处。

3.包含权利要求2所述的威尼斯镰刀菌TB01的整合位点的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.向权利要求1所述的威尼斯镰刀菌TB01的整合位点定点插入不同启动子驱动下的GFP表达盒，其特征在于，含有用于GFP表达盒在威尼斯镰刀菌TB01定点插入所需的CRISPR/Cas9表达载体和供体DNA。

5.向权利要求4所述的威尼斯镰刀菌TB01的整合位点插入基因的方法，其特征在于，针对向威尼斯镰刀菌TB01整合位点定向插入靶基因，构建包含CRISPR/Cas9序列和sgRNA序列的表达载体及相应的供体DNA片段，将权利要求4中所述的载体和供体片段转化所述的威尼斯镰刀菌TB01。

6.威尼斯镰刀菌TB01的整合位点的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、通过原生质体转化法将GFP表达盒导入到威尼斯镰刀菌TB01中，获得GFP表达文库；

S2、从所述GFP表达文库中筛选出中性插入且能够高表达的荧光菌株；

S3、鉴定GFP表达盒在所述荧光菌株中的插入位点，其插入位点具体为1号染色体FVRRES_00686基因上游4886bp处；

S4、以步骤S3确定的插入位点为中心，选取其上下游各600bp区域作为候选序列，采用CRISPR/Cas9介导的基因同源定向重组插入；

S5、通过CRISPR/Cas9介导靶标基因对步骤S4中选取的候选序列进行整合效率、遗传稳定性、菌株生长评估后，确认威尼斯镰刀菌TB01的整合位点包括权利要求1所述的两个整合位点。

7.威尼斯镰刀菌TB01的整合位点在威尼斯镰刀菌TB01基因工程中的应用。