[发明专利]一种用短芽孢杆菌系统生产重组人BAG3蛋白的方法

说明书

本发明所述用短芽孢杆菌系统生产重组人BAG3蛋白的方法，培养人胰腺导管癌细胞提取总RNA、逆转录成cDNA后利用针对Bag3基因的引物进行PCR扩增，得到序列表中的序列1所示Bag3基因；再将Bag3基因片段与载体pNCMO2连接得到重组载体pNCMO2‑Bag3，然后将重组载体pNCMO2‑Bag3转化进E.coliTOP10中保存并扩增重组载体，随后将提取重组载体pNCMO2‑Bag3电转进B.choshinensis得到重组转化体B.choshinensis/pNCMO2‑Bag3，再将B.choshinensis/pNCMO2‑Bag3菌液在MTN培养基中扩大培养，胞外表达目的蛋白并纯化、鉴定，即得到重组人BAG3蛋白。由于本发明所述方法采用短芽孢杆菌表达系统构建重组转化体，因而得到的重组转化子阳性率高，表达过程快速高效，可实现后期大规模扩大培养并简化纯化工艺、降低生产成本。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及生产重组人BAG3蛋白的方法。

背景技术

Bcl-2(凋亡相关基因-2)被认为是一种癌基因，该基因家族转录翻译的一些蛋白质被证明可以控制线粒体外膜通透性进而影响细胞的凋亡。Bag是Bcl-2相关的抗凋亡基因，有Bag1-Bag6共6个成员，在抗细胞凋亡等方面有重要作用。其中Bag3基因转录翻译的蛋白具有多样的生物学功能，通过与不同的蛋白相互作用，BAG3蛋白在细胞内可以影响细胞自噬、抑制凋亡以及参与细胞的应激反应。BAG3蛋白在多种肿瘤细胞中高表达，是维持肿瘤细胞生存的重要分子。近年来有研究报道BAG3蛋白可以由胰腺癌和其他类型肿瘤细胞分泌(Antonia Falco,Alessandra Rosati,Michelina Festa,et al.BAG3 is a Novel SerumBiomarker for Pancreatic Adenocarcinomas.Am J Gastroenterol,2013)，分泌的BAG3蛋白可刺激肿瘤基质巨噬细胞释放维持肿瘤生长和代谢过程的因子(Rosati,Alessandra,Basile,et al.BAG3 promotes pancreatic ductal adenocarcinoma growth byactivating stromal macrophages.Nature Communications,2015)，且分泌的BAG3蛋白可能成为胰腺癌的生物标志物。可见，分泌型BAG3蛋白在多种肿瘤进展，尤其在胰腺癌中发挥重要作用。因此，更高效表达高纯度的人重组BAG3蛋白，将会为深入研究分泌型BAG3在肿瘤进展中作用提供很好的使用工具。

关于人重组BAG3蛋白，目前市场上只有少量厂家销售，且价格很高(4818￥/50μg，abcam)。关于人重组BAG3蛋白的生产(制备)方法，目前还没有文献公开报道，仅在市售人重组BAG3蛋白的产品说明书中记载了表达系统为大肠杆菌Escherichia coli(E.coli)，但并未说明具体生产方法。众所周知，E.coli表达体系存在以下明显缺点：表达的蛋白常形成不溶性的包涵体；表达太快太多易形成构象不正确的异源蛋白；没有转录后的加工机制；翻译后加工修饰体系不完善；细胞膜间隙含大量内毒素等。

受限于商品化重组人BAG3蛋白来源不足、价格昂贵，以及E.coli表达系统的缺陷，有必要开发新的表达系统生产人BAG3蛋白的方法，从而得到生物活性高的重组人BAG3蛋白，并实现大量生产和降低成本。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用短芽孢杆菌系统生产重组人BAG3蛋白的方法，以提高所得重组人BAG3蛋白的活性，并使表达过程快速高效，分离纯化过程简化并降低成本。

本发明的技术方案：

1、培养人胰腺导管癌细胞MiaPaCa2，提取总RNA、逆转录成cDNA后利用针对Bag3基因的引物进行PCR扩增，扩增引物的核苷酸序列如序列表中序列3、序列表4所示，序列3为正向引物，序列4为反向引物，扩增得到的Bag3基因的核苷酸序列如序列表中的序列1所示；