[发明专利]一种高产外膜囊泡介导番茄红素分泌和高产的方法

权利要求书

1.一种高产外膜囊泡介导番茄红素分泌和高产的方法，其特征在于：包括，

通过大肠杆菌缺陷菌Δlpp-ΔnlpI-ΔmlaE-ΔtolA提高外膜囊泡产生，介导番茄红素分泌运出，实现高产番茄红素；

所述大肠杆菌缺陷菌Δlpp-ΔnlpI-ΔmlaE-ΔtolA，基于野生菌BL21(DE3)基因依次敲除基因lpp、nlpI、mlaE、tolA，得到缺陷菌Δlpp-ΔnlpI-ΔmlaE-ΔtolA；

其中，所述敲除的基因lpp的序列如SEQ ID NO：1所示；

所述敲除的基因nlpI的序列如SEQ ID NO：2所示；

所述敲除的基因mlaE的序列如SEQ ID NO：3所示；

所述敲除的基因tolA的序列如SEQ ID NO：4所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：用于敲除基因的质粒包括质粒pCas9和质粒pTarget，其中，

所述质粒pCas9的序列如SEQ ID NO：5所示；

所述质粒pTarget的序列如SEQ ID NO：6所示。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述介导番茄红素的分泌运出，包括，

将生产番茄红素质粒转入大肠杆菌缺陷菌Δlpp-ΔnlpI-ΔmlaE-ΔtolA中，得到生产番茄红素菌株；

将生产番茄红素菌株在发酵培养基中发酵培养，制得番茄红素。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述生产番茄红素质粒，包括质粒pACYCDuet-1-mvaE-mvaS-mvK-pmK-mvaD、pETDuet-1-crtE-crtB-crtI-IDI和pRSFDuet-1-plsB-plsC-mvaE-mvK；其中，

所述质粒pACYCDuet-1-mvaE-mvaS-mvK-pmK-mvaD的序列如SEQ ID NO：7所示；

所述质粒pETDuet-1-crtE-crtB-crtI-IDI的序列如SEQ ID NO：8所示；

所述质粒pRSFDuet-1-plsB-plsC-mvaE-mvK的序列如SEQ ID NO：9所示。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基，包括7g/L葡萄糖、15g/L酵母提取物、2g/L KH₂PO₄、12g/L K₂HPO₄、5g/L胰蛋白胨、1.1g/LMgSO₄、7g/LH₂O、0.5g/L柠檬酸、4g/L甘油。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵培养，包括，

过夜种子培养物在LB培养基中在30℃以220rpm预培养；

在0.1的起始OD600下，将过夜种子接种在50ml发酵培养基中，并在37℃下以220rpm培养4～6h；

加入为诱导剂，并在30℃和220rpm下孵育48～72h。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述诱导剂包括异丙基硫代半乳糖苷。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：异丙基硫代半乳糖苷添加量为0.3～0.5mM。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：异丙基硫代半乳糖苷添加量为0.3mM。

10.如权利要求6所述的方法，其特征在于：孵育时间为72h。