[发明专利]一种香蕉灰纹病菌的PCR检测引物及检测方法

说明书

本发明提供一种香蕉灰纹病菌的PCR检测引物及检测方法，所述PCR检测引物中的上游引物序列为ATGTGCAAGGCCGGTTTCG，下游引物序列为CGTCACATCGGCTCAAATCG。基于该特异性引物，开发出香蕉灰纹病菌的PCR检测方法。利用该引物和检测方法快速检测香蕉灰纹病菌，一次PCR反应结合测序分析即可区分病原物，克服常规鉴定方法的不足，具有特异性强，准确性高、灵敏度高、适用性广及操作简便等优点。

技术领域

本发明涉及农作物真菌病害检测技术领域，具体涉及一种香蕉灰纹病菌的PCR检测引物及检测方法。

背景技术

香蕉(Musa spp.)是热带、亚热带地区重要的草本果树与粮食作物。随着香蕉生产的规模化和集约化程度的提高，病害发生也日趋严重，已对香蕉产量和品质造成严重影响。香蕉灰纹病(Cordana leaf spot of banana)，又称香蕉暗双孢霉叶斑病，主要危害香蕉叶片，在世界香蕉产区普遍发生。发病初期在叶片正面产生水渍状，近圆形或不规则浅褐色病斑扩大后病斑呈椭圆形或梭形，中央呈浅灰色，有同心轮纹，边缘深褐色，病健交界处有黄色晕圈；严重时病斑沿叶缘扩大汇合成与中脉平行的大斑，叶缘呈波浪纹干枯，外围具亮黄色晕圈；田间湿度大时，叶片背面病斑灰褐色，并产生灰色霉状物，即病原菌的分生孢子梗和分生孢子。生产上该病常和香蕉褐缘灰斑病、煤纹病、新月弯孢叶斑病、棒孢叶斑病混合发生，严重时可致全叶干枯，植株早衰，果实产量与品质降低。近年来香蕉灰纹病在我国香蕉产区普遍发生且为害日益严重，已成为我国香蕉产区常见且危害严重的病害之一，因此开展香蕉灰纹病菌病原菌的快速检测，对该病害的早期诊断和及时有效防治具有十分重要的意义。

香蕉灰纹病病菌(Neocordana musae(Zimm.)Hern.-Restr.Crous，异名：Cordanamuase Zimm.)在PDA、PSA、OA等常见培养基上生长缓慢，分离时菌落易被杂菌覆盖，而且分生孢子产生时间晚，早期难以鉴别。另外，基于症状为基础的病害常规诊断技术，需经柯赫氏法则如病原菌分离培养、形态学特征观察、致病性试验及症状分析等步骤，耗时较长，且其准确性和可靠性在很大程度上决定于鉴定者的经验和分类学知识掌握程度；其次，该病还常与其他香蕉叶部病害混合发生，导致很难做到病害初发时及时检测和有效控制病害的传播扩散，难以满足香蕉灰纹病诊断的实际需要，因此迫切需要建立一套方便快捷、结果可靠、灵敏度较高的快速诊断技术。

近年来，随着现代分子生物技术的快速发展和应用，一些分子标记技术为植物病原菌的诊断检测提供了新的途径，其中PCR(polymerase chain reaction)技术以其可快速、特异、灵敏的检测鉴定纯培养菌株和带菌样本的特点受到关注，被广泛应用于植物病原菌的检测。目前国内外研究人员已成功开发出香蕉褐缘灰斑病菌、香蕉炭疽病菌、香蕉黑星病菌、香蕉冠腐病菌等多种香蕉病原菌的特异性引物和检测方法，实现了快速、灵敏和准确的鉴定。但目前有关香蕉灰纹病菌分子检测的研究尚未见报道。

发明内容

针对现有技术对香蕉灰纹病菌的检测和鉴定主要基于病原菌的形态学特征，但因香蕉灰纹病菌生长较缓慢，产孢迟，分离程序繁琐、耗时长、且其准确性和可靠性在很大程度上决定于鉴定者的经验和分类学知识，难以满足香蕉灰纹病诊断的实际需要问题，本发明提供一种专用于香蕉灰纹病病原菌的PCR检测引物及检测方法，实现田间香蕉灰纹病的快速、灵敏和准确的鉴定。

本发明技术方案主要包括以下内容：

一种香蕉灰纹病菌Neocordana musae的PCR检测引物NMF/NMR2，上游引物序列为ATGTGCAAGGCCGGTTTCG，下游引物序列为CGTCACATCGGCTCAAATCG。

本发明涉及所述的PCR检测引物NMF/NMR2在检测香蕉灰纹病菌中的应用。

基于上述特异性检测引物NMF/NMR2，本发明进一步提供一种香蕉灰纹病菌的PCR检测方法，包括以下步骤：

(1)提取待检样品基因组DNA；