[发明专利]一种细胞内活的不可培养细菌的检测方法及其应用

说明书

本发明属于细胞内微生物检测领域，公开了一种细胞内活的不可培养细菌的检测方法及其应用。该方法是从宿主细胞分离出的细菌进行样品洗涤，后用荧光染料SYTO9和PI分别与细菌悬液共孵育标记细菌，随后通过流式细胞仪检测待测细菌悬液样本中的活的不可培养细菌和死细菌的含量。本发明使用灵敏的检测仪器流式细胞仪标记不同状态的细菌、确定最佳实验条件以及调整仪器参数，可以提高对细胞内活的不可培养细菌鉴别的准确度，该方法不仅具有广谱识别性和操作简便性，还能快速、准确检测出活的不可培养细菌，对于临床样品中的活的不可培养细菌的检测具有重要意义。

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，更具体地，涉及一种细胞内活的不可培养细菌的检测方法及其应用。

背景技术

临床中常常将细胞或组织的通过裂解、收集、铺板至实验室培养基并计数菌落形成单位(CFU)，以此来评估细菌的数量，然而我们常常忽略活的不可培养细菌。活的不可培养状态是细菌为抵抗酸性、低温、盐、宿主细胞防御等不利条件而转变的一种适应型表型，活的不可培养细菌的主要特征为它们不会在营养丰富的培养板或肉汤中生长，但仍然保持细菌的结构完整性和代谢活性。细菌能够在哺乳动物细胞中以活的不可培养状态持续存在，并且不容易受到抗生素的影响，这可能有利于这种病原体的无症状携带，延长致病细菌的潜伏期，导致复发性感染，并且在抗生素治疗期间促进细菌存活从而对公众健康构成风险。

目前，对活的不可培养状态最常见的检测方法如下：①通过可能ATP试剂盒检测细菌的活力指标，但该方法非微生物来源会干扰ATP测量，并导致假阳性结果，这限制了实验室研究的应用，并且在工业环境中几乎不适用。②通过PMA结合RT-PCR检测活的不可培养细菌中特定基因的表达；PMA是一种高亲和力的光活性DNA结合染料，可以通过受损的细胞膜进入细胞，与DNA不可逆转地共价结合，但该方法不仅需要确定不同样品鉴定所用的引物，确定引物的特异性和扩增效率、增加提取DNA操作，还可能出现假阳性结果，这种方法步骤繁琐且重复性差，容易造成实验误差，难以实现精确定量。因此，亟需开发一种快速测定活的不可培养细菌的方法，使其具有高灵敏度，广谱适应性，高准确度的优点。

发明内容

为解决上述现有技术中存在的问题。本发明的目的是提供一种细胞内活的不可培养细菌的检测方法。该方法采用了流式细胞仪结合荧光染料SYTO9和PI染色，作为评估细菌活力的准确方法。该方法是将两种核酸染料对预处理后的细菌分别进行染色，经流式细胞仪比较活菌和完全死亡的细菌的分布区域以及活细菌与死细菌的比例确定样品中的活的不可培养细菌。解决了传统的平板培养技术中所忽略的活的不可培养状态细菌，以及克服了培养过程时间长的缺点。可以实现对处于活的不可培养状态的不同细菌进行快速、准确分析。

本发明的另一个目的在于提供上述方法的应用。该方法可应用于临床分离的活的不可培养细菌的检测，有效避免其带来的潜在风险。

本发明的目的通过下述技术方案来实现：

一种细胞内活的不可培养细菌的检测方法，包括以下步骤：

S1.从宿主细胞内分离出细菌样品，用缓冲液洗涤细菌样品后，加入缓冲液重悬，得到细菌样品悬液；

S2.将荧光染料SYTO9和PI分别加入二甲基亚砜中，再用缓冲液稀释得到SYTO9染色工作液和PI染色工作液，将其避光置于-20～4℃冰箱中保存备用；

S3.将SYTO9染色工作液和PI染色工作液分别加入步骤S1的细菌样品悬液中，用涡旋仪离心使其混合均匀，在室温条件下避光孵育，得到染色细菌悬液；

S4.用缓冲液稀释调节染色细菌悬液的浓度，采用流式细胞仪检测染色细菌悬液中的活的不可培养细菌的含量，在最大激发波长和发射波长下可检测绿色荧光和红色荧光的细菌，其中红色荧光为死的细菌，绿色荧光为活的细菌；