[发明专利]用于联合检测急性胃肠炎病毒的五重荧光定量PCR引物和探针组合及检测方法

说明书

本发明公开了一种用于联合检测急性胃肠炎病毒的五重荧光定量PCR引物和探针组合及检测方法。本发明中所检测的五种急性胃肠炎病毒为诺如病毒GI型(NoV GI)、诺如病毒GII型(NoV GⅡ)、甲型肝炎病毒(HAV)、轮状病毒(RoV)与腺病毒(AdV)。本发明建立了同一体系同时检测五种急性胃肠炎病毒的荧光定量PCR检测方法，该方法具有联合检测、快速、特异、灵敏的特点，为临床病毒性急性胃肠炎诊断与食源性传播载体病毒定性定量检测提供技术储备。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种用于联合检测急性胃肠炎病毒的五重荧光定量PCR引物和探针组合及检测方法。

背景技术

急性胃肠炎是一种常见病、多发病，世界卫生组织的研究数据表明5岁以下儿童平均每年约发生3次急性胃肠炎。急性胃肠炎一般为散发感染，但也可暴发流行。

病毒是引起急性胃肠炎的主要病原体，寒冷季节婴幼儿腹泻80％以上是由病毒感染引起。病毒也是集体机构暴发性肠胃炎的首要致病原，主要通过粪口传播，也可通过污染的水源、食物、物品、空气等传播，极易引起大规模群体感染事件。

常见的急性胃肠炎病毒有诺如病毒GI型、GII型、甲型肝炎病毒、轮状病毒与腺病毒等。急性胃肠炎病毒检测可通过病原学或血清学方法，如普通电镜或免疫电镜直接观察样本中病毒颗粒，但电镜样本准备复杂，周期长且操作复杂，主观性强；酶联免疫吸附测定法(ELISA) 检测样本中抗原或特异性抗体，但ELISA试剂盒灵敏度低、特异性差，且抗体的检测不能实现早期诊断。因此，通常采用聚合酶链式反应(PCR)检测病毒核酸，常规的PCR法一次检测一种病毒，因费时费力，临床并未作为常规检验项目；疾控、卫生监督等部门也尚未对食品、饮用水等进行检测。

综上所述，亟需建立急性胃肠炎病毒的快速、特异、灵敏的检测方法，便于大规模、大批量地进行病原诊断、食源性水源性传播载体的检测。

发明内容：

本发明为了解决目前对于常见五种急性胃肠炎病毒：诺如病毒GI型、诺如病毒GII型、甲型肝炎病毒、轮状病毒与腺病毒检测灵敏度低、耗时的问题，提供了一种基于五重荧光定量PCR检测技术对急性胃肠炎病毒联合检测的方法。该方法具有联合检测、快速、特异、灵敏的特点。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

第一方面，本发明提供了一种用于联合检测急性胃肠炎病毒的五重荧光定量PCR引物和探针组合，其能联合检测诺如病毒GI型(NoV GI)、诺如病毒GII型(NoV GⅡ)、甲型肝炎病毒(HAV)、轮状病毒(RoV)与腺病毒(AdV)五种病毒，所述引物和探针组合包括如下组分：

用于检测诺如病毒GⅠ型的第一上下游引物和探针，所述第一上下游引物和探针组合包括如SEQ ID No.1～2所示核苷酸序列的诺如病毒GⅠ型引物和SEQ ID No.3所示核苷酸序列的诺如病毒GⅠ型探针，所述诺如病毒GⅠ型探针的5’端标记有HEX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；

用于检测诺如病毒GⅡ型的第二上下游引物和探针，所述第二上下游引物和探针组合包括如SEQ ID No.4～5所示核苷酸序列的诺如病毒GⅡ型引物和SEQ ID No.6所示核苷酸序列的诺如病毒GⅡ型探针，所述诺如病毒GⅡ型探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团TAMRAR；

用于检测甲型肝炎病毒的第三上下游引物和探针，所述第三上下游引物和探针组合包括如SEQ ID No.7～8所示核苷酸序列的甲型肝炎病毒引物和SEQ ID No.9所示核苷酸序列的甲型肝炎病毒探针，所述甲型肝炎病毒探针的5’端标记有发光ROX基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2；