[发明专利]一种自发永生化树鼩脑微血管内皮细胞系的建立方法

权利要求书

1.一种自发永生化树鼩脑微血管内皮细胞系的建立方法，其特征在于，步骤如下：

（1）从新生树鼩脑部分离获得大脑皮层，用4℃含1%双抗的D-Hanks液反复冲洗3-5次后剪碎，在粉碎的大脑皮层中加入消化液，37℃孵育消化40-60min，每隔20min颠倒混匀一次；消化产物经200目细胞网筛过滤，收集滤网上组织碎块，用含1%双抗的D-Hanks液重悬，离心弃上清；沉淀用含20-25%BSA的DMEM/F-12培养液重悬，4℃下离心，弃上清，得到富集的微血管段；

（2）在富集的微血管段中加入混合消化液进行二次消化，于37℃中消化25-35min，每隔10min颠倒混匀一次，离心后弃上清液，沉淀用含10-20% FBS的DMEM/F-12培养液重悬，离心弃上清，重复此步骤一次；

（3）将步骤（2）中微血管段消化后所得的组织细胞沉淀，用完全培养基重悬混匀，接种在细胞培养瓶中，培养24h后弃旧液，用含1%双抗的PBS冲洗以去除未贴壁细胞和组织碎块，补充新鲜的完全培养基，之后每3天换液一次，连续培养6-9天；观察细胞生长情况，待细胞贴壁面积达60-80%，使用含EDTA 的0.25%胰酶进行首次消化传代；

（4）树鼩脑原代微血管内皮细胞经过2次传代后，开始进行“差速消化+差速贴壁”纯化培养，即加入含EDTA 的0.25%胰酶消化1-2 min，即刻加入完全培养基终止消化，并按照1:2传代；细胞贴壁0.5-1h后，吸去培养液以去除未贴壁细胞，补充新鲜的完全培养基，继续培养2-3d至细胞贴满瓶底80%以上；重复“差速消化+差速贴壁”纯化培养一次，即得到初步纯化的树鼩脑微血管内皮细胞；

（5）对初步纯化的树鼩脑微血管内皮细胞进行消化传代，当细胞铺满瓶底70-80%时，用含5ng/mL嘌呤霉素的完全培养基作用10-12h，之后去除培养液，使用PBS漂洗两次；补充完全培养基继续培养2-3天，至细胞铺满瓶底70-80%，按照1:2进行消化传代，重复嘌呤霉素纯化培养1次，即得到更高纯度的树鼩脑微血管内皮细胞；

（6）将步骤（5）所得纯化的树鼩脑微血管内皮细胞按照1:5进行消化传代，使用不含内皮细胞生长因子的完全培养基持续培养6-8天，每3天换液一次，至细胞铺满瓶底60%-80%，进行消化并按照1:2进行传代，使用不含内皮细胞生长因子的完全培养基，即得到可连续传代的树鼩脑微血管内皮细胞。

2.根据权利要求1所述的自发永生化树鼩脑微血管内皮细胞系的建立方法，其特征在于：步骤（1）中的消化液是含60U/mL DNaseⅠ、2mg/mLⅡ型胶原酶、不含EDTA的0.05%胰酶的PBS溶液；步骤（2）混合消化液是2mg/mL的Ⅱ型胶原酶、2mg/mL的分散酶、60U/mL 的DNase I按体积比1:1:1的比例混合制得。

3.根据权利要求1所述的自发永生化树鼩脑微血管内皮细胞系的建立方法，其特征在于：步骤（3）、步骤（4）中的完全培养基为含10%胎牛血清、1%双抗、1%内皮细胞生长因子的DMEM/F-12培养基。

4.根据权利要求3所述的自发永生化树鼩脑微血管内皮细胞系的建立方法，其特征在于：步骤（6）中不含内皮细胞生长因子的完全培养基是含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F-12培养基。

5.根据权利要求4所述的自发永生化树鼩脑微血管内皮细胞系的建立方法，其特征在于：1%双抗是指1%的青霉素-链霉素溶液。