[发明专利]一种贝莱斯芽孢杆菌YFB3-1及其分离筛选与鉴定方法和应用

权利要求书

1.一种贝莱斯芽孢杆菌YFB3-1，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌YFB3-1在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC M20221140，保藏机构地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号。

2.根据权利1所述的一种贝莱斯芽孢杆菌YFB3-1，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌YFB3-1菌落为乳白色，无光泽，表面皱褶，边缘隆起不整齐，中间凹陷。

3.一种用于分离筛选和鉴定权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌YFB3-1的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)分离：用无菌水清洗蚯蚓表面，然后用酒精对蚯蚓体表消毒并致其死亡，接着解剖取出蚯蚓肠道内含物；

(2)纯化：将步骤(1)得到的含物加入到装有经过灭菌处理的无菌水三角瓶中，振荡后制成悬液，再用无菌水将悬液稀释成10^-3梯度的稀释液、10^-4梯度的稀释液和10^-5梯度的稀释液；将稀释后的10^-3梯度的稀释液涂布在NA培养基的平板上进行培养，将稀释后的10^-4梯度的稀释液涂布到孟加拉红琼脂培养基的平板上进行培养，将稀释后的10^-5梯度的稀释液涂布到改良高氏一号培养基的平板上进行培养；然后挑取三种培养基平板上长势好的单菌落进行划线纯化菌株；

(3)筛选：将百合尖孢镰刀菌在PDA上进行活化，接着用打孔器在活化后的菌落边缘进行打孔，并取菌饼；将菌饼上长有菌丝的一面朝下转接到新PDA平板中央，然后采用十字交叉法点样分离纯化好的菌株进行培养并筛选出对百合病原真菌尖孢镰刀菌拮抗作用最强的拮抗菌株；

(4)鉴定：将步骤(3)所筛选出的拮抗菌株进行形态学鉴定，然后进行分子生物学鉴定，鉴定出所述贝莱斯芽孢杆菌YFB3-1。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤(1)中所述酒精的体积分数为75％。

5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤(2)中所述振荡时间为15-45min，所述NA培养基的成分包括：蛋白胨7.5-15g，牛肉膏2-5g，NaCl 3-6g，琼脂18-22g，去离子水1000mL；所述孟加拉红琼脂培养基成分包括：蛋白胨3-8g，葡萄糖8-12g，MgSO₄·7H₂O0.25-1.5g，K₂HPO₄ 1.0g，孟加拉红0.015-0.045g，琼脂18-22g，去离子水1000mL，质量浓度为1％的链霉素溶液2-5mL；所述高氏1号培养基的成分包括：KNO₃ 0.5-1.5g，可溶性淀粉18-22g，K₂HPO₄0.25-1g，MgSO₄·7H₂O 0.25-1g，NaCl 0.25-1.5g，FeSO₄·7H₂O

0.005-0.015g，琼脂18-22g，去离子水1000mL；所述培养温度为25-45℃。

6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤(3)中所述PDA的制备方法为：将马铃薯去皮切块并称取100-300g，加水煮沸25-45min后制成浸汁，然后加入葡萄糖18-22g，琼脂18-22g，加去离子水定容至1000mL；所述培养温度为25-45℃。

7.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤(4)中所述形态学鉴定的方法为：将拮抗菌划线到所述NA培养基固体平板上，在25-45℃条件下恒温培养箱中培养2-5天，并且记录有单菌落的菌落形态，然后采用革兰氏染色法对菌体染色，观察菌体的形态特征以及扫描电镜观察菌体形态和测量大小进行形态学鉴定；所述分子生物学鉴定的方法为：采用细菌16S rDNA基因片段的通用引物扩增，然后进行基因测序进行分子生物学鉴定。

8.一种利用权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌YFB3-1在防治百合枯萎病上的应用。