[发明专利]检测四种呼吸道病毒的等温多自配引发扩增试剂和试剂盒

说明书

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及检测四种呼吸道病毒的等温多自配引发扩增试剂和试剂盒。本发明提供了一种检测呼吸道病毒的等温多自配引发扩增试剂，针对每种病毒分别设计6条引物，分别是四条混合式引物(DsF、DsR、FIT和RIT)和两条非混合式引物(SteR和SteF)。本发明基于新型等温多自配引发扩增技术(IMSA)建立了对新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒的快速检测方法，整个检测时间可缩短至1.5小时内，检测灵敏度和特异性可与实时荧光定量PCR媲美，并可完成可视化检测，且无需特殊仪器。

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及检测四种呼吸道病毒的等温多自配引发扩增试剂和试剂盒。

背景技术

近年来，核酸扩增技术成为病原微生物快速检测的主要手段。目前，核酸扩增主要基于两种策略：一种是通过升温降温来完成模板变性、退火、延伸：另一种是在等温条件下由特殊功能性酶的作用下，完成模板的大量扩增。传统的聚合酶链式反应(PCR)是基于热循环的核酸分子扩增技术。随着PCR技术的发展，实时荧光定量PCR、多重PCR、巢式PCR及逆转录PCR也相继被开发出来。PCR技术目前已经广泛采用被作为分子诊断的标准分析技术，但在现场检测合床旁检测(POCT)的应用中受限。而等温扩增技术仅需要简单的恒温装置即可实现，且与PCR相比，能在短时间内产生大量扩增子，实现快速检测，但是扩增效率较低。

现有技术开发的新型的等温核酸扩增技术，即等温多自配引发扩增(isothermalmultiple self-matching-initiated amplication，IMSA)，在等温核酸扩增过程中会产生多倍数的能自我配对继而引发循环扩增的特殊核苷酸结构(self-matching structure，SMS)。这种结构的大量产生富集，使得随后循环扩增引发几率明显增加，继而使得扩增效率增加，最终使得检测灵敏度提升。但是目前并没有基于IMSA检测呼吸道病毒的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供检测四种呼吸道病毒的等温多自配引发扩增试剂和试剂盒，可用于可视化检测四种常见的呼吸道病毒，灵敏度高、特异性良好。

本发明提供了一种检测呼吸道病毒的等温多自配引发扩增试剂，所述等温多自配引发扩增试剂包括针对呼吸道病毒的特异基因设计的引物，针对每种呼吸道病毒分别设计6条引物；

当所述呼吸道病毒为新型冠状病毒时，所述特异基因包括ORFlab基因和/或N基因；

当所述呼吸道病毒为甲型流感病毒时，所述特异基因为Matrix基因；

当所述呼吸道病毒为乙型流感病毒时，所述特异基因为NS1基因；

当所述呼吸道病毒为呼吸道合胞病毒时，所述特异基因为Polymerase基因。

优选的，当所述呼吸道病毒为新型冠状病毒时，所述6条引物包括ORF1ab-DsF、ORF1ab-DsR、ORF1ab-FIT、ORF1ab-RIT、ORF1ab-SteF和ORF1ab-SteR，或N-DsF、N-DsR、N-FIT、N-RIT、N-SteF和N-SteR；

其中ORF1ab-DsF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，ORF1ab-DsR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，ORF1ab-FIT的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，ORF1ab-RIT的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，ORF1ab-SteF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，ORF1ab-SteR的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

N-DsF的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，N-DsR的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，N-FIT的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，N-RIT的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，N-SteF的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，N-SteR的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。