[发明专利]基于主成分分析的结构光照明显微成像方法

说明书

本发明公开了一种基于主成分分析的结构光照明显微成像方法，明利用基于主成分分析的“降维”工具将实际成像中与照明相量无关的嘈杂、干扰成分剔除，以提取照明参数主导的“第一主成分”，从根本上消除了影响照明参数精确估计的干扰项，从而以简单高效的方式精准识别亚像素精度的波矢量与初相位。此外，本发明使用一种双窗频域掩码算子进一步抑制干扰噪声，同时将主成分分析涉及的数据量降低近千倍，极大改善了照明参数估计的计算效率、准确性和稳定性。

技术领域

本发明属于超分辨荧光显微成像技术领域，具体为一种基于主成分分析的结构光照明显微成像方法(structured illumination microscopy based on principalcomponent analysis，PCA-SIM)，用于实时活细胞超分辨观测。

背景技术

研究亚细胞尺度的精细生物结构和功能的动态变化过程对了解细胞命运决定机制、揭示生命现象本质以及探索重大疾病机理等有着至关重要的意义。近年来，受激发射损耗显微术(stimulated emission depletion，STED)、结构光照明显微术(structuredillumination microscopy，SIM)、单分子定位显微术(photoactivated localizationmicroscopy/stochastic optical reconstruction microscopy，PALM/STORM)等超分辨成像技术绕开了百余年来似乎一直被认为是无法突破的阿贝衍射极限，在纳米尺度至单分子水平可视化生物分子，以前所未有的时空分辨率探究活细胞结构和动态过程，成为生命科学研究中不可或缺的重要工具。2014年，瑞士皇家科学院将诺贝尔化学奖授予了超分辨荧光显微技术，再一次展现了该技术在人类发展历程中以及未来发展方向上的重要地位[Weiss,P.S.Nobel prizes for super-resolution imaging.(2014).]。

在众多超分辨成像技术中，SIM利用强度正弦调制的结构化照明在频域以空间混频的方式将样品高频信息编码至光学系统的探测通带内，从而实现突破阿贝衍射极限的约100nm横向分辨率的超分辨光学显微成像[Gustafsson,M.G.Surpassing the lateralresolution limit by a factor of two using structured illuminationmicroscopy.J.Microsc.198,82–87(2000).]。相比于PALM、STED等，SIM具有宽视场、快速成像、光漂白和光毒性弱以及对荧光染料的非特异性需求等独特优势，因此特别适合于对活细胞的长期动态超分辨成像[Li,D.et al.Extended-resolution structuredillumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics.Science 349,(2015).]。尽管有着诸多优势，SIM仍然受到一些技术上的挑战，其高质量超分辨图像的数值重建很大程度上依赖于对照明参数的精确估计，这些参数的微小误差会对重建结果产生重大影响，导致干扰定量的重建伪影[Müller,M.,V.,Hennig,S.,Hübner,W.Huser,T.Open-source image reconstruction of super-resolution structuredillumination microscopy data in ImageJ.Nat.Commun.7,1–6(2016).]。此外，“变化多端”的照明参数对实验环境极为敏感，除非严格保持成像条件稳定，否则需要在每帧超分辨图像重建前从获取的原始观测数据中进行逐帧的照明参数提取[Huang,X.et al.Fast,long-term,super-resolution imaging with Hessian structured illuminationmicroscopy.Nat.Biotechnol.36,451–459(2018).]。目前最广泛使用的基于迭代互相关(COR)的参数估计法通过实空间相位梯度形式的亚像素优化提取高精度的照明参数(波矢、初相位、调制度)[Gustafsson,M.G.L.et al.Three-Dimensional Resolution Doublingin Wide-Field Fluorescence Microscopy by StructuredIllumination.Biophys.J.94,4957–4970(2008).]。然而，COR的性能受到维持活细胞长期成像所需的低光漂白和光毒性的严苛成像条件所导致的低信噪比的影响，且复杂耗时的迭代优化过程大大降低了SIM的图像重建效率，对快速、实时、长时程、无伪影的活细胞动态超分辨成像构成了严峻挑战。