[发明专利]一种基于色相变化的免疫层析试纸条及使用方法

权利要求书

1.一种基于色相变化的免疫层析试纸条，其特征在于，包括PS底板(7)、样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(6)和吸水垫(5)，在PS底板(7)表面的起始端至末端依次粘贴有样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(6)和吸水垫(5)，结合垫(2)两侧分别与样品垫(1)和硝酸纤维素膜(6)重叠，对于两个重叠部分，结合垫(2)位于样品垫(1)下方，硝酸纤维素膜(6)位于结合垫(2)下方；硝酸纤维素膜(6)与吸水垫(5)部分重叠，对于重叠部分，硝酸纤维素膜(6)位于吸水垫(5)下方；

所述样品垫(1)为玻璃纤维膜，待测样品滴加于样品垫(1)上；

所述结合垫(2)表面喷涂有抗体2标记的红色荧光微球；

所述硝酸纤维素膜(6)作为结果的呈现窗口，设置有测试线(3)和质控线(4)，测试线(3)和质控线(4)之间的距离为4～6mm；测试线(3)靠近结合垫，固定有抗体1和绿色荧光微球；质控线靠近吸水垫，质控线(4)上固定有抗体1对应的二抗。

2.根据权利要求1所述的一种基于色相变化的免疫层析试纸条，其特征在于，所述抗体1为链霉亲和素、抗地高辛抗体中的一种，所述抗体2为链霉亲和素、抗地高辛抗体中的另一种，抗体1和抗体2为不同种类的抗体。

3.根据权利要求1所述的一种基于色相变化的免疫层析试纸条及使用方法，其特征在于，

所述绿色荧光微球为dSiO₂@gQDs@SiO₂，是以dSiO₂为模板，gQDs自组装和包封的复合纳米材料；

所述红色荧光微球为dSiO₂@AuNPs@SiO₂@rQDs，是以dSiO₂为模板、AuNPs和rQDs逐层自组装和包封的复合纳米材料。

4.根据权利要求1所述的一种基于色相变化的免疫层析试纸条，其特征在于，在硝酸纤维素膜(6)上设置测试线(3)和质控线(4)的方法为：

取绿色荧光微球gSQS离心并重悬在含1％w/v Tween-20的PBS缓冲溶液中，加入抗体1溶液并超声混匀，得到gSQS-抗体1混合溶液，即为测试线溶液；

将测试线溶液和质控线溶液分别以1μL/cm的速度，用三维平面点膜喷金仪在硝酸纤维素膜上划线，烘干后即得测试线和质控线。

5.采用权利要求1～4任一所述的免疫层析试纸条检测食源性致病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)提取待测样品的基因组DNA；

步骤2)对待测样本进行恒温扩增；

步骤3)利用CRISPR/Cas12a对核酸扩增产物进行识别与切割；

步骤4)采用免疫层析试纸条对步骤3)的反应产物进行检测；

步骤5)对免疫层析试纸条检测结果进行定性及半定量判读。

6.根据权利要求5所述的免疫层析试纸条检测食源性致病菌的方法，其特征在于，所述步骤3)中，

利用CRISPR/Cas12a对核酸扩增产物进行切割的反应条件为：Cas12a、crRNA、抗原1和抗原2同时标记的单链DNA、步骤2)的扩增产物、切割缓冲液；

切割温度为30～40℃，切割时间为10～30min。

7.根据权利要求6所述的免疫层析试纸条检测食源性致病菌的方法，其特征在于，

所述ssDNA探针为抗原1和抗原2同时修饰的寡核苷酸，包括5’-Digoxin-TTTTTTTTTTTTTT-Biotin-3’、5’-Biotin-TTTTTTTTTTTTTT-Digoxin-3’、5’-Digoxin-TTTTTTTTT-Biotin-3’或5’-Digoxin-TTTATTTATTTATT-Biotin-3’；

所述抗原1和抗原2分别对应抗体1和抗体2，抗原1和抗原2为生物素、地高辛中的一种。