[发明专利]基于虚拟数字切片扫描系统和图像识别的球形荧光微塑料计数方法及其应用

说明书

本发明公开了基于虚拟数字切片扫描系统和图像识别的球形荧光微塑料计数方法，包括：将虚拟数字切片扫描系统VS120应用于荧光微塑料模型粒子的计数中，实现对滤膜的全面积拍照；还利用形状判别算法识别图像中的球形荧光微塑料；并通过消除重叠/覆盖圆、消除低亮度荧光杂质算法，在保证识别准确度的情况下，实现批量处理荧光微塑料图片的功能，极大程度地提高了图片处理效率。本发明还公开了一种荧光微塑料标准溶液配制方法，该方法能够配制已知丰度的微塑料标准溶液。

技术领域

本发明属于荧光微塑料计数技术领域，具体涉及基于虚拟数字切片扫描系统和图像识别的球形荧光微塑料计数方法及其在荧光微塑料标准溶液配制上的应用。

背景技术

随着社会经济发展、科学进步和人民生活水平的提升，人们的饮用水安全意识也在不断地提高。微塑料是一种三维尺寸均在0.001-5mm范围内的塑料颗粒，是目前在饮用水中发现的新兴污染物之一，近年来已引起了学界和民众的广泛关注。

在围绕饮用水中微塑料展开的一系研究中，荧光微塑料模型粒子的应用已十分常见。由于制作工艺的制约，目前科研工作者使用的荧光微塑料模型粒子大多为球形颗粒。现有研究中，荧光微塑料水样丰度的检测方法有流式细胞仪法、显微镜-肉眼计数法和显微镜-图像识别法等。

流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置，近年来开始被用于水样中荧光微塑料的定量分析。但流式细胞仪对样品中荧光微塑料的丰度有一定要求，一般要求水样中荧光微塑料的丰度在105-107个/mL，此丰度远远高于饮用水中微塑料的赋存丰度(2-30个/mL)和饮用水-微塑料研究中所设计的微塑料丰度(1-100个/mL)。上述原因导致流式细胞仪定量分析饮用水样品中的荧光微塑料需要进行大体积采样与繁琐的浓缩操作。而实验室内开展的饮用水相关实验(如烧杯实验)多采用小体积采样法，且浓缩过程也极易造成样品的损失与破坏，因此流式细胞仪法不适用于定量检测低浓度、小采样体积的荧光微塑料样品。

由于饮用水中荧光微塑料样品具有低浓度、小采样体积的特点，研究中一般优先选择显微镜-图像识别法。显微镜-肉眼计数法和显微镜-图像识别法都需要将水样中的微塑料抽滤至滤膜上，然后使用显微镜对滤膜进行观察，其中显微镜-肉眼计数法采用人眼直接观察、人工判断与计数，效率低下且错误率高，现阶段的研究已基本不采用此方法。更为常见的是显微镜-图像识别法，该方法可根据图像处理的不同逻辑分为显微镜-荧光强度法和显微镜-连通区域法。显微镜-荧光强度法是使用显微镜拍摄滤膜上的荧光微塑料图像后，根据所摄图片的不同荧光强度代表荧光微塑料的相对数量。显微镜-荧光强度法对微塑料荧光强度的稳定性、一致性以及图像拍摄的参数一致性有较高的要求，且无法避免荧光杂质带来的较大误差。显微镜-连通区域法同样采用显微镜采集滤膜上的荧光微塑料图像，使用Image J对图像中前景像素的联通区域进行识别与计数。显微镜-连通区域法无法分离团聚的荧光微塑料，同时也无法避免荧光杂质的干扰。此外，现有的显微镜-图像识别法使用的显微镜不具备大视野扫描功能，导致拍摄方式局限于随机/分区随机拍照，此类拍摄方式将严重受到微塑料在滤膜表面分布不均匀性的影响，进而造成较大误差。因此，现有的显微镜-图像识别法无法实现荧光微塑料标准球形粒子的高准确性、高稳定性计数。

OLYMPUS VS120虚拟数字切片扫描系统是应用于组织病理学、神经生物学、发育生物学等研究领域的虚拟切片扫描类大型仪器。VS120利用全自动显微镜扫描系统，结合虚拟切片软件，把传统切片进行扫描、无缝拼接，生成一整张全视野的数字切片，以此化解高分辨率和大视野间的矛盾。

使用超声、磁力搅拌、涡旋振荡后的荧光微塑料溶液仍然存在微塑料分布不均匀的问题，因此传统的溶解性药品标准溶液配制方法并不适用于荧光微塑料标准溶液。由于现有的计数方法对样品溶液中荧光微塑料绝对数量的计数存在较大误差，因此荧光微塑料标准溶液的配制问题一直无法被解决。

发明内容

本发明提供了一种基于虚拟数字切片扫描系统和图像识别的球形荧光微塑料计数方法，该方法能够快速准确的测定饮用水样品中荧光微塑料的丰度。