[发明专利]一种基于定向偶联技术的电荷介导微通道电流生物传感方法及其应用

权利要求书

1.一种基于定向偶联技术的电荷介导微通道电流生物传感方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

S1预先将点击试剂1修饰在微通道内表面，待检测时加入偶联有点击试剂2的生物识别分子，诱发点击反应使生物识别分子定向偶联固定于微通道内壁，依次加入待测目标物和含有检测抗体、牛血清白蛋白的自组装蛋白球进行免疫捕获反应，蛋白球可以对每个抗原-抗体特异性结合反应进行信号放大，使微通道内表面的电荷状态发生变化，电荷密度的改变量与待测目标物浓度相关；

S2修饰后的微通道固定于两个导电液池中间，成为连接两个导电液池的唯一通道，在微通道两端的导电池中分别插入正负电极并施加恒定的电压或电流，电极-电解质-微通道之间形成闭环电路；

S3样品溶液通过微通道，发生特异性的生物识别反应，再加入含有检测抗体、牛血清白蛋白的自组装蛋白球，由于蛋白质表面带有负电荷，蛋白质聚集成蛋白球可以引起更大的微通道内电荷密度改变，进而导致闭环电路的电流变化，变化程度与微通道内电荷密度相关，从而可得到待测目标物含量。

2.根据权利要求1所述基于定向偶联技术的电荷介导微通道电流生物传感方法，其特征在于：所述步骤S1中，点击试剂1和点击试剂2包括四嗪基团（TZ）-反式环辛烯（TCO）、叠氮-炔、二苯并环辛炔（DBCO）-叠氮（Azide）、半胱氨酸（Cys）-氰基苯并噻唑（CBT）或其他。

3.根据权利要求1所述基于定向偶联技术的电荷介导微通道电流生物传感方法，其特征在于：所述生物识别分子为能够与待测目标物发生免疫反应的抗体、抗原，或所述生物识别分子为能够特异性捕获微生物的噬菌体，或所述生物识别分子为能够与待测目标物发生DNA分子杂交反应的捕获探针的核酸适配体，或所述生物识别分子为特异性捕获待测目标物的纳米抗体。

4.根据权利要求1所述基于定向偶联技术的电荷介导微通道电流生物传感方法，其特征在于：所述修饰微通道内壁的生物识别分子浓度为1 μg/mL~30 μg/mL；当向正极电极和负极电极施加恒定的电压时，所述电压为50-300v。

5.根据权利要求1所述基于定向偶联技术的电荷介导微通道电流生物传感方法，其特征在于：所述步骤S1中，微通道为毛细管，生物识别分子通过定向偶联技术修饰在微通道内表面，其具体操作包括以下步骤；

S1 A.1用盐酸冲洗毛细管以去除附着在内壁上的污染物；

S1 A.2继续用氢氧化钠冲洗毛细管，以活化毛细管内壁硅羟基；

S1 A.3取表面固定化原子转移自由基聚合引发剂[11-(2-溴-2-甲基)丙酰氧基]十一烷基三氯硅烷（5 wt%，溶于甲苯）注入毛细管微通道内反应，反应结束后，依次用甲苯和甲醇清洗微通道；

S1A.4硅基嵌段接枝共聚：将2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、溴化铜和2，2'-联吡啶加入脱气后的甲醇中，并将混合溶液注入毛细管微通道中，聚合反应；聚合反应完成后，向微通道中注入CuBr₂溶液，使微通道内表面为溴离子端基，完成嵌段共聚；

S1A.5将N-(2-氨基乙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐、溴化铜和2，2'-联吡啶加入异丙醇与水的混合溶液（异丙醇/水= 8:2 v/v）中，将混合溶液与[11-(2-溴-2-甲基)丙酰氧基]十一烷基三氯硅烷搅拌；

S1A.6将酪氨酸酶溶液与葡萄球菌A蛋白溶液在室温下孵育后，注入毛细管微通道中，室温下反应；

S1A.7将TCO溶解于DMF中，注入毛细管微通道中室温孵育；反应完毕用PBST清洗，加入5% BSA封闭，PBST清洗后置于4℃中保存备用；

S1 A.8取TZ溶解于DMF中，室温下将TZ和生物识别分子混合搅拌；反应完成后，在上述混合液中加入Tris-HCl终止反应，将上述混合液加入透析袋中透析；最后，将制备好的TZ-生物识别分子偶联物保存于-20℃备用；待检测时注入毛细管微通道中，即完成修饰过程。