[发明专利]基于均相时间分辨荧光技术的体外RIG-I激活检测的方法

权利要求书

1.基于均相时间分辨荧光技术的体外RIG-I激活检测的方法，其特征在于，所述方法通过将RIG-I蛋白分为CARD结构域片段和解旋酶结构域片段，并以二者片段的结合程度反应RIG-I的活性，同时采用均相时间分辨荧光技术对RIG-I的活性进行量化，且具体包括以下步骤：

S10：将纯化的仅含CARD结构域的蛋白片段与仅含解旋酶结构域的蛋白片段共稀释于溶解有RIG-I激动剂或待检测物的缓冲液中；

S20：对CARD结构域片段和解旋酶结构域片段进行荧光抗体标记；

S30：读取反应体系激发后的荧光信号并经计算转换成RIG-I的活性值；

并且RIG-I蛋白来源于人源，并通过昆虫表达系统或哺乳动物表达系统进行表达制备。

2.根据权利要求1所述的基于均相时间分辨荧光技术的体外RIG-I激活检测的方法，其特征在于，在步骤S10中，

所述缓冲液包括用于稳定反应体系酸碱度的酸溶液、用于模拟生理环境盐度的金属盐溶液、用于模拟细胞内低氧分压环境的还原剂、用于模拟细胞内高浓度蛋白环境的牛血清白蛋白及用作RIG-I辅助因子的ATP与镁盐溶液。

3.根据权利要求2所述的基于均相时间分辨荧光技术的体外RIG-I激活检测的方法，其特征在于，

所述ATP的添加浓度位于2~5mM之间。

4.根据权利要求1所述的基于均相时间分辨荧光技术的体外RIG-I激活检测的方法，其特征在于，在步骤S20中，

所述CARD结构域片段和解旋酶结构域片段预先融合用于蛋白纯化和后续抗体标记的标签，

所述用于蛋白纯化的标签不能干扰后续抗体的识别或者利用蛋白酶纯化后进行切除；

所述CARD结构域片段和解旋酶结构域片段需要各自融合不同的标签用于抗体的识别，各识别标签的抗体之间不存在交叉反应，且均不与RIG-I存在交叉反应；以及

选择的抗体均含有荧光素标记，且荧光素组合会产生能量共振转移现象。

5.根据权利要求4所述的基于均相时间分辨荧光技术的体外RIG-I激活检测的方法，其特征在于，

用于纯化目的的融合标签选自GST、多聚组氨酸、SUMO及MBP中的至少一种；和/或，

用于抗体识别的融合标签选自GST、FLAG、myc、V5及HA中的至少一种；和/或，

所标记的荧光素组合为铽（Tb）与异硫氰基荧光素（FITC）、DyLight 488及Alexa Flour488中的一种进行组合；或者为铕（Eu）和APC进行组合。

6.根据权利要求1所述的基于均相时间分辨荧光技术的体外RIG-I激活检测的方法，其特征在于，在步骤S30中，

利用酶标仪读取反应体系激发后的荧光信号Rnλ₁/λ₂，其中，所述λ₁为标记解旋酶结构域片段荧光素的发射波长，所述λ₂为标记CARD结构域片段荧光素的发射波长。